Transdução de Embriões Fertilizados de Rato Baseada em Vetores Lentivirais

Resumo

Fonte: Koza, P., et al. Geração de Ratos Transgênicos utilizando uma Abordagem com Vetor Lentiviral. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a entrega assistida por microinjeção de vetores lentivirais em embriões de rato fertilizados para obter integração estável de transgenes na geração de ratos transgênicos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê apropriado de ética em experimentação animal.

1. Microinjeção de vetores lentivirais em embriões de um único estágio celular sob a zona pelúcida
   OBSERVAÇÃO: Utilize embriões em estágio de uma célula com dois pronúcleos visíveis para microinjeção (Figura 1).
   1. Descongele a alíquota de lentivírus (LV) à temperatura ambiente e centrifugue a 10.000 x g e temperatura ambiente (TA) durante 2 min para pelotizar quaisquer resíduos celulares remanescentes.
   2. Configuração para microinjeção
      1. Prepare pipetas de contenção de vidro (capilar de vidro borossilicato) utilizando um microforjador. Puxe o capilar de vidro sobre uma chama para produzir uma ponta de 5–10 cm. Quebre a pipeta deixando uma ponta de aproximadamente 4 cm. O diâmetro externo deve ser de aproximadamente 80–120 µm.
         OBSERVAÇÃO: Certifique-se de que a ponta da pipeta seja perfeitamente reta e lisa.
      2. Monte a pipeta puxada em um microforge com a ponta diante do filamento de aquecimento. Aqueça o filamento bem próximo à ponta da pipeta e deixe-a encolher até um diâmetro de ~15 µm (aproximadamente 20% do tamanho do embrião). Posicione a pipeta perpendicularmente ao filamento de aquecimento, a 2–3 mm da ponta da pipeta, e inicie o aquecimento. O vidro irá amolecer. Aqueça até atingir um ângulo de 15°. 15° ângulo
      3. Prepare capilares de vidro borossilicato para microinjeção com filamento utilizando um puxador de pipetas. Insira o capilar na câmara de puxamento. Realize um teste de rampa (pela primeira vez com vidro novo e toda vez após a troca do filamento). Ajuste o Calor para o valor da rampa menos 10, Tração para 100, Velocidade para 150 e Tempo para 100.
         OBSERVAÇÃO: Modifique os parâmetros para obter uma capilar de injeção ideal.
      4. Sob uma capela de fluxo laminar de biossegurança, carregue aproximadamente 2 µL da solução viral na pipeta de microinjeção com uma ponta microloader.
      5. Prepare um prato de microinjeção (tampa de placa de Petri de 60 mm) com uma 100 µL gota de meio M2 (no centro), coberta com parafina líquida ou óleo mineral.
      6. Monte a pipeta de contenção e a capilar de microinjeção carregada com a solução viral em um micromanipulador e em uma placa de microinjeção sob um microscópio invertido.
   3. Realizar a microinjeção
      1. Transfira 15–20 embriões de estágio unicelular para a gota de meio M2 no prato de microinjeção. Segure o embrião utilizando uma pipeta de contenção.
      2. Usando aumento de 400x, injete a solução de LV sob a zona pelúcida até o espaço perivitelino utilizando a capilar de vidro conectada a um injetor automático. Mantenha a capilar sob a zona pelúcida por um momento.
         OBSERVAÇÃO: Usando pressão positiva suave, a solução viral fluirá continuamente para fora da pipeta de injeção, mas o volume da suspensão administrado não pode ser controlado.
      3. Usando uma pipeta fina, devolva os embriões à placa de cultura no incubador a 37 °C em uma atmosfera com 5% de CO₂₂ atmosfera. O número de injeções de um único zigoto pode variar e pode ser adaptado com base na concentração do vetor viral.
         OBSERVAÇÃO: Os embriões injetados podem ser transferidos para mães substitutas no estágio de uma célula ou incubados durante a noite em meio M16 antes de serem transferidos no estágio de duas células. Deve-se evitar o cultivo prolongado de embriões de rato in vitro.

Resultados

Figura 1. Fotografia microscópica de embrião de rato em estágio de uma célula preparado para injeção subzonal de vetor lentiviral. O embrião foi imobilizado com uma pipeta de contenção. São visíveis os dois pronúcleos que contêm o material genético materno e paterno, bem como o corpo polar. Barra de escala = 20 μm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Conjuntos de tubos de aspiração para pipetas micrométricas calibradas	Sigma	A5177-5EA
Capilares de vidro borossilicato com filamento GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	Capilar de injeção
Prato de cultura celular CELLSTAR, 35 mm	Greiner Bio-One	627160
Prato de cultura celular CELLSTAR, 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Óleo mineral	Sigma	M8410-500ML
Microscópio invertido	Zeiss	Axiovert 200
Meio M2	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	Suporte para capilar
Meio M16 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D