Purificação de Integrase Viral Utilizando Cromatografia de Afinidade

Resumo

Fonte: Lopez Jr., M. A., et al. Detecção e Remoção de Contaminação por Nucleases Durante a Purificação da Integrase do Vírus Espumoso Protótipo Recombinante. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a purificação da integrase viral com marcação de polihistidina utilizando cromatografia de afinidade por níquel. O protocolo utiliza eluição com gradiente de imidazol para isolar seletivamente a integrase com base em sua afinidade pela resina carregada com níquel.

Protocolo

1. Cromatografia de Afinidade por Níquel

1. Deixe descongelar um pellet bacteriano em gelo.
   NOTA: Isso levará um tempo considerável (aproximadamente 2 - 3 h). Quando o pellet estiver descongelado em uma suspensão celular, adicione um volume adicional de Fluoreto de Fenilmetanosulfonila (PMSF) 500 μM (solução estoque 100 mM).
2. Mantenha o tubo de 50 mL com a suspensão bacteriana em gelo. Sonique as bactérias com amplitude de 30% durante 30 s (1 s ligado, 1 s desligado) por pellet derivado de 1 L de cultura, utilizando um sonicador com uma ponteira bioacústica de diâmetro 0,5 polegada e microponta cônica de diâmetro 0,125 polegada, frequência de 20 kHz e potência máxima de 400 W.
3. Transfira a amostra celular para um tubo de ultracentrífuga frio. Utilize conjuntos de frascos de policarbonato (diâmetro de 25 mm, altura de 89 mm) compatíveis com rotor fixo Tipo 60 Ti. Tubos e rotores alternativos podem ser usados se a mesma força gravitacional for alcançada. Centrifugue a 120.000 x g durante 60 min a 4 °C. Deve-se observar um pellet evidente. O sobrenadante pode apresentar coloração amarelada.
4. Transfira o sobrenadante por decantação ou pipetagem para um tubo cônico de 50 mL frio. Anote o volume; esse volume deve ser aproximadamente igual ao volume do tampão de ressuspensão usado antes do congelamento rápido. Se o sobrenadante estiver viscoso, pode estar contaminado com DNA bacteriano, o que poderia entupir a coluna de cromatografia. Nesse caso, repita a ultracentrifugação para precipitar o DNA bacteriano.
5. Prepare 500 mL do Tampão A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL do Tampão B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazol).
   NOTA: Neste protocolo, mantenha o sistema de cromatografia líquida de proteínas de alta eficiência (FPLC), todos os tampões e a amostra a 4 °C em uma câmara fria.
   1. Filtre esterilmente os Tampões A e B com unidades descartáveis de filtro de 0,2 μm. Dependendo do sistema FPLC, lave a bomba A e a bomba B com o Tampão A e o Tampão B, respectivamente. Passe 90% do Tampão A e 10% do Tampão B pelo sistema até que as leituras de condutividade e de ultravioleta (UV) se estabilizem. A taxa de fluxo máxima dependerá do instrumento; utilize uma taxa de fluxo de 5 mL/min com limite máximo de pressão de 1,0 MPa.
6. Prepare uma coluna FPLC de 110 mm de comprimento e 5 mm de diâmetro com 1,5 mL de resina carregada com níquel (capacidade máxima de ligação de 50 mg/mL, pressão máxima de 1 MPa). A coluna pode ser preparada no dia anterior à purificação e armazenada a 4 ˚C.
7. Conecte a coluna ao instrumento FPLC. Equilibre a coluna com 20 mL de 90% do Tampão A e 10% do Tampão B (20 mM imidazol) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min com limite máximo de pressão de 0,5 MPa. O instrumento deve coletar dados em tempo real de condutividade e absorbância UV a 280 nm (A₂₈₀). As leituras de condutividade e UV devem se estabilizar. Se essas leituras não se estabilizarem, continue passando os tampões pela coluna até que fiquem estáveis.
8. Carregue a amostra proteica (~10 mL por pellet) na coluna a uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min com limite máximo de pressão de 0,5 MPa. A taxa de fluxo e a pressão da coluna permanecem as mesmas durante toda a purificação. Colete o fluxo de passagem em um tubo de 50 mL.
   1. Lave a coluna com 20 mL de 90% do Tampão A e 10% do Tampão B. Colete a lavagem em um tubo de 50 mL. Elua as proteínas com um gradiente linear de 20 mL de 10% a 100% do Tampão B (20 mM a 200 mM imidazol).
   2. Finalmente, lave a coluna com 5 mL de 100% do Tampão B (200 mM imidazol). Colete o gradiente e a lavagem final em frações de 0,27 mL.
9. Combine 15 μL de tampão amostra 2x SDS-PAGE com 15 μL das frações de fluxo de passagem, lavagem e pico de A₂₈₀. Ferva as amostras por 3 min.
   1. Prepare dois géis de SDS-PAGE a 10%. Carregue 10 μL de cada amostra nos géis e 4 μL de padrões proteicos pré-estainados. Execute, cora e analise os géis.
   2. Combine as frações que aparentemente contêm integrase do vírus espumoso protótipo (PFV IN) quase pura com base na inspeção visual. Meça o volume por pipetagem, normalmente entre 8 - 10 mL.
   3. Utilizando um espectrofotômetro, meça a A₂₈₀ das frações combinadas e calcule a quantidade total de proteína PFV IN; o rendimento típico é de ~10 mg por litro de cultura induzida. O coeficiente de extinção do PFV IN com a marcação de hexahistidina é 59360 cm^-1 M^-1.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
Imidazol	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430