Purificação de Integrase Viral Utilizando Cromatografia de Afinidade por Heparina

Resumo

Fonte: Lopez Jr., M. et al. Detecção e Remoção de Contaminação por Nucleases Durante a Purificação da Integrase Protótipo Recombinante do Vírus Espumoso. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o procedimento para purificar a integrase viral a partir de contaminação por nuclease bacteriana utilizando cromatografia em coluna de heparina Sepharose seguida de análise por SDS-PAGE para confirmar a pureza da proteína.

Protocolo

1. Cromatografia de afinidade com heparina
   1. Prepare 250 mL do Tampão C (50 mM cloreto de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl), pH 7,5, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0,1 mM ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 500 μM fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)) e 250 mL do Tampão D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
      NOTA: Neste protocolo, o sistema de cromatografia líquida de proteínas rápida (FPLC), os tampões e a amostra são mantidos em uma câmara fria a 4 ˚C.
      1. Filtre esterilmente os Tampões C e D com unidades de filtro descartáveis de 0,2 μm. Dependendo do sistema FPLC, lave a bomba A e a bomba B com o Tampão C e o Tampão D, respectivamente. Passe 80% do Tampão C e 20% do Tampão D pelo sistema até que as leituras de condutividade e ultravioleta (UV) se estabilizem. A taxa de fluxo máxima dependerá do instrumento; rotineiramente utilizamos uma taxa de fluxo de 5 mL/min com um limite máximo de pressão de 1,0 MPa.
   2. Prepare uma coluna FPLC com 80 mm de comprimento e 5 mm de diâmetro, contendo 1 mL de resina de heparina Sepharose (capacidade máxima de ligação de 2,0 mg de antitrombina III bovina por mL de resina; pressão máxima de 1,4 MPa). A coluna pode ser preparada no dia anterior à purificação e armazenada a 4 °C. Conecte a coluna ao instrumento FPLC.
      1. Equilibre a coluna com 20 mL de 80% do Tampão C e 20% do Tampão D (200 mM NaCl) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min com um limite máximo de pressão de 1 MPa. O instrumento deve coletar dados em tempo real de condutividade e absorbância UV a 280 nm (A₂₈₀). As leituras de condutividade e UV devem se estabilizar. Caso essas leituras não tenham se estabilizado, continue passando os tampões pela coluna até que fiquem estáveis.
   3. Reduza a concentração de NaCl da amostra de integrase do vírus espumoso protótipo (PFV IN) para 200 mM adicionando 1,5 volume do Tampão C. Por exemplo, adicione 15 mL do Tampão C a 10 mL de PFV IN. O volume total geralmente é de ~25 mL.
   4. Carregue a amostra diluída de PFV IN na coluna de heparina Sepharose a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min com um limite máximo de pressão de 1,0 MPa. A taxa de fluxo e a pressão da coluna permanecem as mesmas durante toda a purificação. Colete o fluxo inicial em um tubo cônico de 50 mL.
      1. Lave a coluna com 20 mL de 80% do Tampão C e 20% do Tampão D (200 mM NaCl), coletando a lavagem em um tubo cônico de 50 mL. Elua a coluna com um gradiente linear de 30 mL de 20% a 100% do Tampão D (200 mM a 1 M NaCl).
      2. Lave a coluna com 5 mL de 100% do Tampão D. Colete o gradiente e a lavagem final em frações de 0,37 mL.
   5. Analise a carga, o fluxo inicial, a lavagem e as frações por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 8% (SDS-PAGE). O PFV IN, após a clivagem da marcação hexahistidina, possui um peso molecular de 44.394 Da, e o coeficiente de extinção permanece 59.360 cm^-1 M^-1 sem a marcação hexahistidina. Armazene todas as frações a 4 ˚C até a conclusão de um ensaio de nucleases.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo)	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (Fluoreto de fenilmetanosulfonila)	Amresco	754
DTT (Ditiotreitol)	P212121	SV-DTT
EDTA UltraPure	Invitrogen/Gibco	15575
Heparina Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01