Este vídeo descreve o ensaio de placa viral utilizando partículas de pseudovírus de coronavírus. O pseudovírus diluído é adicionado a uma monocamada de células de mamífero, seguido por incubação com uma cobertura de metilcelulose. As placas formadas por células infectadas são contadas visualmente para determinar a titulação do vírus infeccioso.
Artigo de método
Quantificação de Partículas de Pseudovírus por Ensaio de Placa
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30 de setembro de 2026
Neste artigo
Resumo
Protocolo
Titulação do vírus da estomatite vesicular que expressa a proteína spike do coronavírus e a proteína verde fluorescente melhorada (pseudovírus VSV-S-eGFP)
1. Diluição seriada para determinar o título viral
1. Plaque as células Vero E6 em placas de 6 poços com uma densidade de semeadura de 6 × 105 células por poço em Meio Essencial Modificado de Dulbecco ou DMEM (com 10% de SBF (Soro Bovino Fetal)) e incube durante a noite a 37 °C com 5% de CO₂.
NOTA: Células Vero que superexpressam TMPRSS2 e hACE2 também podem ser utilizadas.
2. Prepare uma série de diluições seriadas de 10 vezes do vírus VSV-SeGFP em DMEM sem soro e frio, colocando 900 μL de meio em sete tubos de microcentrifugação. Rotule os tubos de 1 a 7. Adicione 100 μL do estoque viral ao primeiro tubo e vortexe brevemente. Transfira 100 μL do vírus diluído do tubo 1 para o tubo 2 e vortexe brevemente; continue até o tubo 7.
3. Aspire o meio de todos os poços da placa de 6 poços contendo células Vero E6 e substitua por 500 μL das diluições 105 a 107. Incube as placas por 45 min a 37 °C com 5% de CO₂, agitando suavemente a cada 15 min.
Aspire o inóculo e substitua pela camada de cobertura contendo uma mistura 1:1 de DMEM 2x e 6% de carboximetilcelulose (CMC), concentração final de 3% de CMC, suplementada com 10% de FBS; incube a 34 °C com 5% de CO₂ por 48 h.
NOTA: Pré-aqueça a mistura de cobertura em banho-maria a 37 °C por 15 min durante a etapa de infecção. Uma mistura 1:1 de agarose a 1% com DMEM 2x suplementado com 10% de FBS pode ser usada em substituição ao CMC. Para aplicar a cobertura com agarose, ferva a agarose a 1% (em dH₂O) e misture com DMEM 2x frio. Certifique-se de que a mistura esteja em uma temperatura adequada antes de adicioná-la à monocamada celular (aproximadamente 37-40 °C). Se a agarose for usada como cobertura, as células devem ser fixadas mediante incubação em 2 mL de metanol:ácido acético na proporção 3:1 por pelo menos uma hora antes da coloração.
2. Coloração e cálculo do título viral
1. Visualize as placas por meio de coloração com violeta cristal ou visualização direta de eGFP em microscópio fluorescente.
2. Para corar as placas, aspire a camada de revestimento, lave uma vez com PBS e, em seguida, adicione 2 mL de violeta de cristal a 0,1% (em metanol a 80% e dH₂O) a cada poço. Incube na plataforma agitadora por aproximadamente 20 min à temperatura ambiente antes da descoloração. Remova o violeta de cristal e lave suavemente cada poço duas vezes usando dH₂O ou PBS.
NOTA: Os passos de lavagem e coloração devem ser realizados com cuidado, pipetando lentamente em direção à lateral de cada poço para garantir que a monocamada celular permaneça intacta durante todo o procedimento.
3. Deixe as placas secarem por pelo menos 1 h antes de contar as placas. Certifique-se de que as contagens de placas sejam obtidas de poços contendo de 20 a 200 placas. Para calcular o título do vírus em unidades formadoras de placa (PFU) por mL, multiplique o fator de diluição do poço contado pelo volume de infecção e divida esse número pelo número de placas presentes no respectivo poço.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| tripsina-EDTA 0,25% | Fisher scientific | LS25200114 | |
| células Vero E6 | ATCC | CRL-1586 | |
| celulose carboximetílica | Sigma | C5678 | |
| meio Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| meio Eagle modificado por Dulbecco (Pó) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| penicilina/estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| anticorpo neutralizante contra a proteína Spike do SARS-CoV-2 (2019-nCoV), Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 |
