Neutralização Mediada por Anticorpos de Pseudovírus que Expressam a Proteína Spike de Coronavírus Utilizando Soro de Pacientes

Resumo

Fonte: Jamieson, T. R., et al. Detecção de Anticorpos Neutralizantes de SARS-CoV-2 utilizando Imagem Fluorescente de Alto Rendimento da Infecção por Pseudovírus. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a neutralização mediada por anticorpos de pseudovírus que carregam proteínas spike de coronavírus utilizando soro de pacientes, analisada por meio de imagem fluorescente de alto rendimento de monocamadas de células epiteliais infectadas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê de ética institucional (IRB).

1. Diluições de anticorpos ou soros e infecções

NOTA: Este protocolo pode ser aplicado para medir a neutralização do vírus da estomatite vesicular que expressa a proteína spike do coronavírus e a proteína verde fluorescente melhorada (VSV-S-eGFP), pseudovírus, por anticorpos comercialmente disponíveis e soro de pacientes, bem como soro coletado de animais para estudos pré-clínicos de desenvolvimento de vacinas.

1. Série de diluição serial
   1. Antes de diluir as amostras de soro, inative cada amostra por calor em banho-maria a 56 °C por 30 min para inativar o complemento. Assegure as precauções de segurança necessárias ao manipular amostras de pacientes; abra os recipientes de amostras apenas na cabine de segurança biológica, e use equipamento de proteção individual apropriado para nível de contenção 2.
   2. Monte a série de diluição em uma placa de 96 poços vazia (Placa 1).
   3. Inicie todas as diluições na Linha A da placa de 96 poços com 80 µL. *Para amostras de pacientes, inicie a série de diluição na proporção de 1 para 10, colocando 8 µL de soro em 72 µL de meio Dulbecco modificado de Eagle sem soro (DMEM) (com 1% de penicilina/estreptomicina).
      NOTA: A concentração do anticorpo neutralizante utilizada dependerá da atividade prevista pelo fabricante. Para o anticorpo neutralizante contra a proteína Spike do SARS-CoV-2 usado aqui (veja a Tabela de Materiais), comece com 5 µg/mL para observar pelo menos 50% de neutralização.
   4. Adicione 40 µL de DMEM sem soro (com 1% de penicilina/estreptomicina) às linhas B a G, e 80 µL à linha H. Não adicione vírus à linha H, pois ela serve como controle apenas com células.
   5. Utilizando uma pipeta multicanal de 12 canais, misture e transfira 40 µL do soro ou anticorpo diluído da linha A para a linha B. Misture e repita até a linha F, descartando 40 µL da linha F. Não adicione soro à linha G, pois ela representa a linha controle apenas com vírus.
2. Infecção e cobertura
   1. Prepare um volume apropriado de VSV-S-eGFP diluído para tratar cada poço com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,05 (ou 2000 unidades formadoras de placa (pfu)). (Ao realizar este cálculo, considere que apenas 60 µL do volume total de 80 µL serão transferidos para as células; portanto, certifique-se de multiplicar o volume do vírus por 1,33 para manter 2000 pfu).
      NOTA: Como o VSV-S-eGFP é sensível à temperatura, mantenha os estoques virais em gelo sempre que não estiverem em uso, e evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, pois os títulos variarão após congelamentos sucessivos.
   2. Adicione 40 µL de vírus diluído a cada poço das linhas A a G da Placa 1 e misture pipetando para cima e para baixo 4-5 vezes. Incube a placa por 1 h a 37 °C com 5% de CO₂.
   3. Retire a placa contendo as células do incubador (Placa 2) e aspire cuidadosamente o meio de todos os poços. Transfira 60 µL da mistura anticorpo/vírus da Placa 1 para a Placa 2 e incube por 1 h a 37 °C com 5% de CO₂, agitando a placa a cada 20 min.
   4. Complete cada poço com 140 µL de cobertura contendo carboximetilcelulose (CMC) em DMEM para uma concentração final de 3% de CMC (com 10% de FBS (soro bovino fetal) e 1% de penicilina/estreptomicina). Coloque a Placa 2 em um incubador ajustado a 34 °C com 5% de CO₂ por aproximadamente 24 h antes da aquisição de imagens.
      NOTA: Pré-aqueça a mistura de cobertura em banho-maria a 37 °C por 15 min durante a etapa de infecção.

2. Imagem e quantificação (Dia 3)

1. Imageie as placas usando um leitor de fluorescência automatizado (com filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou um filtro alternativo com comprimento de onda de excitação de 488 nm). Quantifique a infecção viral criando um protocolo que identifique e conte automaticamente os focos individuais de eGFP (proteína verde fluorescente melhorada). Se uma função de contagem automática não estiver disponível, utilize o software ImageJ para quantificar o número de focos de eGFP.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Carboximetilcelulose	Sigma	C5678
Meio Essencial Modificado de Dulbecco (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Meio Essencial Modificado de Dulbecco (Pó) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Células Vero E6	ATCC	CRL-1586
Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV