Monitoramento da Expressão Gênica Específica de Estágio no Vírus Vaccinia Utilizando Repórteres Fluorescentes

Resumo

Fonte: Rozelle, D. K., et al. Vírus Repórteres da Vacínia para Quantificar a Função Viral em Todas as Etapas da Expressão Gênica. J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo demonstra um método para monitorar a replicação do vírus vaccinia utilizando repórteres fluorescentes regulados por promotores específicos de cada fase. A expressão sequencial das proteínas fluorescentes verde, vermelha e azul marca as fases inicial, intermediária e tardia da infecção, permitindo a análise em alto rendimento da expressão gênica viral específica de cada fase.

Protocolo

1. Semear Células

1. Dissocie as células HeLa da placa e dilua no meio de crescimento (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% soro bovino fetal [FBS]) até aproximadamente 2,0 x 10⁵ células/ml. Distribua 100 μl por poço em uma placa de 96 poços com paredes pretas e fundo claro e plano (20.000 células por poço).
2. Incube as células por 24 horas até atingirem confluência em um incubador a 37 °C + 5% CO₂.

2. Infectar células

1. Dilua os vírus e infecte as células.
   1. Descongele o vírus TrpV (vírus triplo; Venus precoce, mCherry intermediário, TagBFP tardio) e o vírus fluorescente PLV (Venus sem promotor) e desagregue por sonicação durante 5 minutos. Alternativamente, os estoques brutos de vírus podem ser misturados na proporção de 1:1 com tripsina a 0,25 mg/ml no meio de infecção e incubados a 37 °C por 30 min.
   2. Dilua os estoques brutos de vírus no meio de infecção a 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Para infecções com alta MOI (10 PFU/célula), dilua o estoque de vírus para 1,0 x 10⁷ PFU/ml, considerando 5 x 10⁴ células/poço e um volume de inóculo de 50 μl. Planeje infectar 3 poços replicados para cada tratamento com TrpV e outros 3 poços replicados para o mesmo tratamento com PLV, a fim de levar em conta a fluorescência de fundo específica de cada tratamento.
   3. Infete os poços adicionando 50 μl/poço do vírus diluído no meio de infecção. Isso é definido como tempo = 0 hr pós-infecção (0 hpi).
2. Incube de 6 a 24 hr em uma incubadora a 37 °C + 5% CO₂.

3. Fixar células

1. Fixe as células adicionando 100 μl de paraformaldeído a 8% ao meio de infecção já presente em cada poço. Incube à temperatura ambiente por 15 min protegido da luz.
   NOTA: Recomenda-se adicionar diretamente o paraformaldeído 2x (8%) ao meio de infecção para evitar a aerossolização do vírus vaccinia infeccioso, que pode ocorrer se o meio de alto título for invertido diretamente na cuba de resíduos antes da fixação.
2. Remova o fixador invertendo a placa na cuba de resíduos.
3. Adicione 100 μl de solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente.
4. Selar a placa com filme adesivo opticamente transparente.
   NOTA: As placas podem ser armazenadas a 4 °C se não forem lidas imediatamente. Certifique-se de retornar as placas seladas à temperatura ambiente antes da leitura para evitar que a condensação distorça as medições do espectrofotômetro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	11995-065
Soro Bovino Fetal - Optima, Inativado pelo Calor (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
L-Glutamina 200 mM (L-glut)	Gibco	25030-081
Microplacas de Poliestireno Tratadas para Cultivo Celular (TC), Pretas, com Fundo Claro e Plano, 96 Poços	Corning	3603
Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
Filme óptico transparente TempPlate RT	USA Scientific	2978-2700
Meio Reduzido de Soro Opti-MEM	Gibco	31985-070