Isolamento e Purificação de Vírus de Corpos de Insetos Infectados

Resumo

Fonte: Biesbrock, A. M. et al. Propagação do Homalodisca coagulata virus-01 por meio de cultura celular de Homalodisca vitripennis. J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo demonstra a propagação in vitro do Homalodisca coagulata Virus-01 utilizando células hospedeiras derivadas de insetos. Ele descreve os passos para purificação do vírus, inoculação e replicação dentro de células de insetos cultivadas.

Protocolo

1. Extração do Vírus Inteiro

1. Homogeneizar corpos inteiros de H. vitripennis positivos para o vírus em tampão fosfato, pH ~7,2, com 0,02% de dieticarbamato de sódio tri-hidratado (DETCA) por vortexagem em intervalos de ~10 segundos até que não haja mais grandes aglomerados de tecido presentes. Extrair o vírus por centrifugação ultrarrápida a 124.500 x g durante 4 horas a 4 °C ou a 22.000 x g durante 16 horas a 4 °C. Se um precipitado se formar na parte superior, removê-lo com um cotonete estéril.
2. Descartar o sobrenadante.
3. Coletar o pellet e dissolvê-lo com 5 ml de tampão fosfato 10 mM (sem DETCA), pH ~7,2, contendo 0,4% de ácido Na-deoxicólico e 4% de éter de polietileno glicol hexadecílico (Brij 52).
   1. Para misturar bem o pellet, remover o pellet da parede do tubo e triturá-lo até que esteja completamente em solução, se necessário.
   2. Adicionar tampão fosfato 10 mM adicional em incrementos de ~5 ml para ajudar o pellet a entrar em solução, se necessário, e combinar em 2 tubos.
4. Centrifugar a solução a 300 x g por 15 minutos.
5. Remover o sobrenadante e passar a solução por um filtro de 0,45 μm, coletando o filtrado em um tubo coletor grande.
6. Transferir o filtrado para uma membrana de diálise com corte de peso molecular (MWCO) de 3,5 kD, usando pequenas quantidades de tampão fosfato 10 mM (pH 7) sem DETCA, se necessário.
7. Colocar a membrana de diálise em um béquer grande cheio com ddH₂O a 4 °C. Trocar a ddH₂O a cada hora durante 5 a 6 horas, até que um precipitado branco se forme na membrana.
8. Coletar o vírus purificado do interior da membrana e submeter a solução de vírus a 100% a uma série de diluições dez vezes consecutivas, adicionando 10 μl da solução a 90 μl de ddH₂O. Posteriormente, adicionar 10 μl da diluição a outros 90 μl de ddH₂O até atingir uma diluição de 1:100.000.
9. Armazenar a solução de vírus a -80 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de cultura celular Corning	Sigma Aldrich	CLS430168	Área de superfície 25 cm², pescoço inclinado, tampa (selo tipo plug)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Microscópio invertido e câmera
Placas de cultura multiwell Greiner CELLSTAR	Sigma Aldrich	M8937	48 poços (com tampa, tratada para cultura de células)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Di-etil-ditiocarbamato de sódio tri-hidratado
Sistema de filtração a vácuo com frasco de boca larga Corning	Sigma Aldrich	CLS431206	Membrana de acetato de celulose, tamanho de poro 0,45 μm, área da membrana 54,5 cm², capacidade de filtração 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Éter de polietileno glicol hexadecílico
Solução de tampão fosfato	Sigma Aldrich	P5244	Recebido como 100 mM, diluído para 10 mM com água estéril
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Solução salina tamponada com fosfato
Albumina sérica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Meio para insetos de Grace (suplementado, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
L-histidina mono-hidratada	Sigma Aldrich	H8125	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Meio 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Meio 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Sais balanceados de Hank (1x)	Sigma Aldrich	51322C	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
L-Glutamina (100x)	Sigma Aldrich	G3126	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
MEM, mistura de aminoácidos (50x)	Sigma Aldrich	56419C	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Solução de MgCl 1 M	Sigma Aldrich	M8266	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Nistatina	Sigma Aldrich	N6261	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Gentamicina	Sigma Aldrich	46305	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Componente do meio H2G+ para cigarrinha
Soro fetal bovino	Sigma Aldrich	F2442	Componente do meio H2G+ para cigarrinha