Geração de Lentivírus Recombinante em Células Mamíferas

Resumo

Fonte: Zhang, Y., et al., Reprogramação Direta de Fibroblastos de Camundongo em Melanócitos. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a produção e concentração de lentivírus recombinante em células de mamífero, permitindo a entrega eficiente de fatores de transcrição ou outros elementos genéticos para aplicações como reprogramação celular, estudos funcionais e pesquisas terapêuticas potenciais.

Protocolo

1. Construção de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para fatores de transcrição

1. Produção do vírus concentrado (Figura 1A, B)
   1. Plaque 1,5 × 10⁶ células HEK (rimão embrionário humano)-293T em uma placa de 60 mm e cultive essas células com meio normal (consulte Tabela 1) a 37 °C em um incubador umidificado com 5% de CO₂.
      NOTA: Se o vírus precisar ser embalado em lotes, pode-se usar uma placa de cultura celular de 100 mm (para detalhes, consulte Tabela 2).
   2. Após 24 h, certifique-se de que as células HEK-293T tenham atingido 80-90% de confluência no dia da transdução e substitua o meio por 3,5 mL de DMEM (meio Eagle modificado de Dulbecco) (150 µL de DMEM por 1 cm²). Mantenha as células a 37 °C em um incubador umidificado com 5% de CO₂ por 2 h.
      NOTA: O meio de substituição deve ser livre de soro, para que as células possam ser "privadas de nutrientes" e assim obter uma melhor transfeção de plasmídeo.
   3. Prepare a mistura de plasmídeos (mistura A) contendo 3 µg dos plasmídeos-alvo Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ou Snai2; 1 µg do plasmídeo de embalagem PMD2.G e 2 µg do plasmídeo de embalagem PSPAX2. Complete o volume da mistura A até 150 µL com DMEM sem soro. Prepare a mistura do reagente de transfeção (mistura B) adicionando 12 µL do reagente de transfeção (o volume é duas vezes a massa total de todos os plasmídeos) e complete o volume da mistura B até 150 µL com DMEM sem soro.
      NOTA: Ao preparar as misturas, é importante adicionar o líquido lentamente para evitar bolhas de ar.
   4. Misture a mistura A e a mistura B após deixá-las em repouso por 5 min à temperatura ambiente. Incube a mistura à temperatura ambiente por 20-30 min para formar o complexo de transfeção.
   5. Retire as células HEK-293T do incubador, substitua o meio por DMEM + 2% de FBS (soro bovino fetal), adicione a mistura do passo 1.1.4 gota a gota e misture o líquido suavemente.
   6. Após 8 h, troque o meio por 3,5 mL de meio normal. Após a troca do meio, colete o sobrenadante viral a cada 24 h e 48 h.
   7. Misture os sobrenadantes virais coletados em dois momentos diferentes. Centrifugue a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Passe o sobrenadante por filtros de 0,45 µm e colete-o em um tubo cônico estéril de 50 mL.
      NOTA: O vírus coletado às 24 h pode ser armazenado a 4 °C e misturado com o vírus coletado às 48 h.
   8. Concentre o sobrenadante viral por centrifugação a 6000 × g a 4 °C durante a noite (~16 h). Certifique-se de que o pellet viral seja visível no fundo do tubo cônico após a centrifugação.
   9. Despeje o sobrenadante lentamente. Dissolva o pellet viral em um volume de meio normal equivalente a 1/100^o do volume do sobrenadante viral. Usando uma micropipeta P1000, pipete suavemente para cima e para baixo até obter uma mistura homogênea. Divida o vírus concentrado em tubos de microcentrífuga conforme necessário. Armazene a −80 °C.
      NOTA: O vírus é concentrado 100 vezes com este método. O vírus concentrado (100x) pode ser armazenado por >1 ano a −80 °C. Evite congelamentos e descongelamentos repetidos do vírus.

Tabela 1: Componentes dos meios normais e de reprogramação.

	Componentes	Dose (concentração, volume)	Concentração final
Meio normal (100 mL)	DMEM/GLICOSE ALTA	89 mL
	FBS inativado pelo calor	10 mL
	Antibióticos (Pen/Strep)	10000 U/mL, 1 mL	100 U/mL
Meio de reprogramação (100 mL)	RPMI-1640	88 mL
	FBS inativado pelo calor	10 mL
	SCF humano recombinante	200 μg/mL, 50 μL	100 ng/mL
	bFGF humano recombinante	4 μg/mL, 250 μL	10 ng/mL
	Insulina humana recombinante	10 mg/mL, 50 μL	5 μg/mL
	EDN3 humano	100 μM, 100 μL	0,1 μM
	Toxina da cólera	0,3 mg/mL, 0,56 μL	20 pM
	Forbol 12-miristato 13-acetato (TPA)	1 mM, 20 μL	200 nM
	Hidrocortisona	100 μg/mL, 500 μL	0,5 μg/mL
	Adenina	40 mg/mL, 60 μL	24 μg/mL

Tabela 2: Detalhes do sistema de empacotamento de lentivírus.

Prato de cultura	Densidade de semeadura (células/prato)	Meio (mL)	Sistema de plasmídeo			Reagente de transfeção (µL)
			Plasmídeo alvo (μg)	PMD2.G (μg)	PSPAX2 (μg)
35 mm	6 ×105	1.5	1.5	0.5	1	6
60 mm	1.5 × 106	3.5	3	1	2	12
100 mm	4 × 106	8	8	3	6	34

Resultados

Figura 1: Produção do vírus concentrado e estimativa do título. (A) Intensidade de fluorescência da GFP (proteína verde fluorescente) após infecção de células HEK-293T com lentivírus não concentrado (1x) e lentivírus concentrado (100x) (B) Comparação das taxas de infecção do lentivírus não concentrado (1x) e do lentivírus concentrado (100x), detectadas por citometria de fluxo. (C) Estimativa do título do lentivírus concentrado. Barras de escala = 250 µm. Abreviações: GFP = proteína verde fluorescente; TU = unidades de transdução.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de 0,45 μm	Millipore	SLHVR33RB
Etanol 95%/100%	LANBAO	210106	Armazenado à temperatura ambiente
Antibióticos (Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Armazenado a -20 °C
Anticorpo anti-TRP2/DCT	Abcam	ab74073	Hospedeiro/Isótipo: IgG de coelhoReatividade com espécies: Camundongo/Humano Diluição de 1:200 para uso
DMEM (alta glicose)	HyClone	SH30243.01	Armazenado a 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Armazenado à temperatura ambiente
FBS	Gibco	10270-106	Armazenado a -20 °CInativado pelo calor antes do uso
Gelatina	Sigma	G9391	Armazenado à temperatura ambiente
Plasmídeos GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Armazenado a -20 °C
Hematoxilina	Abcam	ab220365	Armazenado à temperatura ambiente
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-019	Reagente de transfeção, armazenado a 4 °C
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Armazenado à temperatura ambiente
Forbol 12-miristato 13-acetato (TPA)	Sigma	P8139	Concentração estoque 1 mMConcentração final 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	Reagente catiônico polimérico para transfeção; Concentração estoque 8 μg/µLConcentração final 4 ng/µL
Puromicina	Gibco	A11138-03	Armazenado a -20 °C
FGF humano recombinante	Invitrogen	13256-029	Concentração estoque 4 μg/mLConcentração final 10 ng/mL
Insulina humana recombinante	Sigma	I3536	Concentração estoque 10 mg/mLConcentração final 5 µg/mL