Este vídeo demonstra como um plasmídeo minigenoma tetracistrônico, que imita o genoma do vírus Ebola, é transfectado em células humanas juntamente com plasmídeos auxiliares. Dentro das células, proteínas virais e luciferase são expressas, levando à montagem e brotamento de partículas virais semelhantes a vírus, não patogênicas e competentes para replicação.
Artigo de método
Produção de Partículas Semelhantes a Vírus Competentes para Transcrição e Replicação do Vírus Ebola Contendo Repórter
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30 de setembro de 2026
Neste artigo
Resumo
Protocolo
1. Transfecção de Células Produtoras para a Produção Inicial de Partículas Semelhantes a Vírus Competentes para Transcrição e Replicação ou trVLPs
- 24 hr após a divisão das células (ver Figura 1 para uma visão geral do cronograma do experimento), pipete o DNA plasmidial (para as quantidades, ver Tabela 1) em um criovial estéril de 2 mL utilizando ponteiras filtradas. Adicione 100 µL de OptiMEM por poço ao DNA. Vortexe a mistura brevemente e centrifugue suavemente os tubos usando uma microcentrífuga. Se vários poços forem transfectados com plasmídeos idênticos, pode-se preparar uma mistura-mestre para vários poços.
- Vortexe brevemente o frasco com Transit LT1 antes do uso. Adicione 7,5 µL de Transit LT1 por poço ao DNA diluído. Vortexe suavemente a mistura, tomando cuidado para não acumular líquido na tampa do criovial, e incube por 15 min à temperatura ambiente.
- Misture suavemente o complexo de transfeção pipetando para cima e para baixo. Adicione 100 µL dos complexos de transfeção gota a gota a cada poço. Agite a placa para frente/trás e de lado a lado para distribuir os complexos de transfeção. Não gire a placa, pois isso causará uma distribuição desigual dos complexos de transfeção.
- Retorne as células ao incubador.
- Após 24 hr, remova o sobrenadante das células. Adicione 4 mL de DMEM (Meio Eagle Modificado por Dulbecco) com 5% de FBS (Soro Bovino Fetal), 2 mM de L-glutamina, 1x pen/strep (Penicilina/Estreptomicina) (DMEM5) às células. Este passo pode ser realizado com até 3 poços simultaneamente sem que os poços sequem, desde que os poços contenham amostras idênticas (caso contrário, devido à natureza autossustentável dos trVLPs (Partículas Semelhantes a Vírus Competentes para Transcrição e Replicação) neste sistema, a contaminação cruzada pode se tornar um problema, e este passo deve ser feito um poço por vez).
- Retorne as células ao incubador.
Tabela 1. Quantidades de DNA para transfeção. A quantidade de cada plasmídeo necessária para a transfeção de células produtoras e células-alvo é mostrada em ng por poço de uma placa de 6 poços.
| Células Produtoras (p0) | Células-alvo (p1 e superiores) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| pCAGGS-L | 1.000 | 1.000 |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-Tim1 | - | 250 |
Resultados
Figura 1. Temporização de um ensaio trVLP tetracistônico para 3 passagens consecutivas. Os dias para semeadura de células (s), transfeção de células (t), infecção de células (i), troca de meio (c) e coleta de células e trVLPs (h) são indicados para três passagens consecutivas (indicadas por setas).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frasco de cultura de células de 75 cm² | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | Pré-aquecer a 37°C antes do uso |
| FBS | Life technologies | 26140-079 | Inativar em banho-maria a 56°C por 30 min |
| L-Glutamina | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| Placas de 6 poços | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 |
