Ensaio Baseado em Luciferase para Avaliar Compostos Antivirais em Células de Rim Embrionário Humano

Resumo

Fonte: Lucas-Hourani, M. et.al., Triagem em Alta Escala para Inibidores Químicos de Amplo Espectro de Vírus de RNA. J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo mostra um ensaio antiviral baseado em luciferase em células de rim embrionário humano infectadas com vírus da sarampo recombinante. Ele demonstra que compostos-teste diluídos em série inibem a replicação viral, resultando em menor luminiscência de maneira dependente da dose, ao mesmo tempo que mantêm a viabilidade das células hospedeiras.

Protocolo

1. Preparação de Culturas Celulares Infectadas pelo Vírus do Sarampo (MV) Expressando Luciferase de Vaga-Lume (rMV2/Luc)

1. Cultive células HEK-293T a 37 °C e 5% CO₂ em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com L-glutamina estabilizada e suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), estreptomicina (100 μg/ml) e penicilina (100 UI/ml). As células são repassadas por tripsinização a cada 4-5 dias e diluídas na proporção de 1:10 em um novo frasco. As células devem estar na fase log para os experimentos.
2. No dia do experimento, recupere as células por tripsinização e realize a contagem celular. Peliculize as células por centrifugação e ressuspenda-as a 3 x 10⁵ células/ml em meio de cultura. Considere que 12,5 ml de suspensão celular são necessários para cada placa de triagem.
3. Novamente, ressuspenda as células a 3 x 10⁵ células/ml em meio de cultura. Considere que 12,5 ml de suspensão celular são necessários para cada placa de triagem.
4. Opcional: suplemente o meio de cultura com uridina a 20 μg/ml.
   NOTA: Ao triar bibliotecas químicas por inibidores da replicação viral, parece que compostos que atuam nas etapas iniciais da via de biossíntese de pirimidinas são frequentemente isolados. A adição de uridina ao meio de cultura é utilizada para filtrar essas moléculas antivirais. De fato, isso restaura eficientemente a replicação viral quando enzimas upstream da via de biossíntese de pirimidinas estão bloqueadas.
5. Reserve 1:10 da suspensão celular para poços controle com células não infectadas e prossiga com a infecção com o volume restante.
6. Descongele o volume apropriado da solução estoque de rMV2/Luc. As soluções estoque de MV geralmente contêm entre 10⁶ e 10⁸ partículas infecciosas por ml. A cultura deve ser infectada com 0,1 partícula infecciosa de rMV2/Luc por célula-alvo, o que corresponde a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1. 
   NOTA: rMV2/Luc é derivado da vacina contra o sarampo (linhagem Schwarz) e deve ser manipulado em ambiente BSL2.
7. Adicione o vírus à suspensão celular e misture suavemente. Transfira as células infectadas para um reservatório e distribua 100 μl da suspensão celular infectada nas colunas 2 a 11 de placas D2 contendo compostos químicos adicionados. A suspensão celular no reservatório deve ser misturada suavemente com frequência.
8. Nas colunas 1 e 12, distribua 100 μl de células não infectadas em cada poço. Células infectadas são distribuídas nos demais poços.
9. Incube as células por 24 h a 37 °C e 5% CO₂.

2. Triagem Secundária para Toxicidade e Atividade Antiviral de Amplo Espectro

1. Realize diluições seriadas 1:2 para cada composto ativo em dimetilsulfóxido (DMSO), começando de 500 µM até 4 µM (8 diluições). Preencha placas de cultura tecidual brancas, com código de barras, com 50 µl de meio de cultura. Adicione 1 µl de cada diluição do composto aos poços de cultura. Repita duas vezes para obter 3 placas de cultura com diluições seriadas duplicadas para cada composto ativo.
2. Prepare 37,5 ml de uma suspensão celular de HEK-293T a 6 x 10⁵ células/ml em meio de cultura conforme descrito acima (em 1.1 e 1.2). Distribua 2x 12,5 ml em tubos Falcon e infecte as células com rMV2/Luc em MOI = 0,1 ou com o vírus recombinante chikungunya (CHIKV) expressando luciferase Renilla (CHIKV/Ren) em MOI = 0,2. Misture invertendo os tubos.
   NOTA: CHIKV/Ren é derivado de uma linhagem selvagem de CHIKV e, portanto, deve ser manipulado em ambiente BSL3. As placas podem ser transferidas do BSL3 para o BSL1 após a adição do substrato Renilla aos poços de cultura (ver abaixo).
3. Distribua 50 µl de células não infectadas, infectadas com rMV2/Luc ou infectadas com CHIKV/Ren em placas de cultura contendo diluições seriadas dos compostos ativos. Incube por 24 h a 37 °C.
4. Adicione 50 µl de substrato de luciferase de vaga-lume para determinar a atividade da luciferase em poços infectados com rMV2/Luc. Adicione 50 µl de substrato de luciferase Renilla para determinar a atividade da luciferase Renilla em poços infectados com CHIKV/Ren. Finalmente, adicione 50 µl de reagente de ensaio de viabilidade baseado em luciferase às células não infectadas para determinar a viabilidade celular.
5. Represente graficamente os dados (Figura 1) e determine as concentrações dos compostos ativos que inibem a replicação de MV e CHIKV em 50%. Descarte compostos que apresentem alguma toxicidade neste ensaio.

Resultados

Figura 1. Atividade antiviral dose-resposta e toxicidade dos compostos C864, C648 e C062. (A) Células HEK-293T foram infectadas com a cepa rMV2/Luc do vírus do sarampo (MV) que expressa luciferase (MOI=0,1) e incubadas com doses crescentes de C864, C648, C062 ou apenas DMSO. Após 24 horas, a expressão de luciferase foi determinada. * indica que as inibições observadas da luciferase foram estatisticamente significativas com os três compostos (valores de p < 0,05). (B) Células HEK-293T foram infectadas com a cepa CHIKV/Ren do vírus chikungunya (CHIKV) que expressa luciferase Renilla (MOI=0,2) e incubadas com doses crescentes de C864, C648, C062 ou apenas DMSO. Após 24 horas, a expressão de luciferase Renilla foi determinada. * indica inibições estatisticamente significativas com os três compostos (valores de p < 0,05). (C) Células HEK-293T foram incubadas com doses crescentes de C864, C648, C062 ou apenas DMSO. Como controle de toxicidade, os cultivos celulares foram suplementados com 2,5 μl de uma solução a 0,5% de IGEPAL. Após 24 horas, o número de células vivas foi determinado utilizando o ensaio de viabilidade baseado em luciferase.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plataforma Freedom EVO	TECAN		Plataforma robótica
Microplacas de cultura celular de poliestireno, brancas, com 96 poços	Greiner Bio One	655083
Ensaio luminométrico de viabilidade celular CellTiter-Glo	Promega	G7570	Ensaio de viabilidade baseado em luciferase
Sistema de ensaio de luciferase Bright-Glo	Promega	E2610	Reagente contendo o substrato da luciferase de vaga-lume
Sistema de ensaio de luciferase Renilla-Glo	Promega	E2710	Reagente contendo o substrato da luciferase Renilla
Sistema de ensaio de gene repórter Britelite plus	Perkin-Elmer	6016761	Reagente contendo o substrato da luciferase de vaga-lume. Pode ser usado como alternativa ao reagente Bright-Glo para determinar a atividade da luciferase.