Isolamento de um Único Vírus Gigante de uma População Viral Mista Utilizando Amebas

Resumo

Fonte: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Microaspiração de Célula Única como uma Estratégia Alternativa à Classificação de Células Ativadas por Fluorescência para Separação de Misturas de Vírus Gigantes. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a microaspiração de célula única para isolar e expandir uma única população de vírus gigante a partir de uma população viral mista, utilizando amebas como células hospedeiras.

Protocolo

1. Cultura de Amebas

1. Utilize Vermamoeba vermiformis (linhagem CDC19) como suporte celular.
2. Adicione 30 mL de meio protease-peptona-extrato de levedura-glicose (PYG) (Tabela 1) e 3 mL de amebas com concentração de 1 x 10⁶ células/mL em um frasco de cultura celular de 75 cm².
3. Mantenha a cultura a 28 °C.
4. Após 48 h, quantifique as amebas utilizando lâminas de contagem.
5. Para a lavagem, recolha as células com concentração de 1 x 10⁶ células/mL e pelote as amebas por centrifugação a 720 x g durante 10 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet no volume apropriado de meio de inanição para obter 1 x 10⁶ células/mL (Tabela 1).

2. Diluição em ponto final

1. Realize uma diluição seriada (10^-1 a 10^-11) da amostra viral em meio de inanição (Tabela 1).
2. Inocule 2 mL de 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis em cada placa de Petri com 100 µL do inóculo da mistura.
3. Coloque as placas de Petri em um saco plástico fechável a 30 °C.
4. Inicie a observação das placas de Petri por microscopia óptica invertida 6 h após a infecção e verifique a morfologia celular a cada 4 a 8 h.
5. Na ocorrência do efeito citopático caracterizado pelo arredondamento celular, inicie o processo de microaspiração de célula única.

3. Microaspiração de Célula Única

1. Prepare o hospedeiro
   NOTA: Este preparo é feito para a liberação de células infectadas em um suporte celular fresco.
   1. Trate as amebas em cultura com um agente antimicrobiano contendo 10 µg/mL de vancomicina, 10 µg/mL de imipenem, 20 µg/mL de ciprofloxacina, 20 µg/mL de doxiciclina e 20 µg/mL de voriconazol. Essa mistura é usada para evitar contaminação bacteriana e fúngica.
      NOTA: O procedimento ocorre em uma bancada fora da estação de segurança microbiológica. Adicione 2 mL de amebas concentradas a 1 x 10⁶ células/mL em cada uma das 15 placas de Petri. Para aderência das amebas, incube a cultura a 30 °C por 30 min.
2. Selecione a placa de Petri utilizada para a microaspiração a partir da diluição limite segundo os seguintes critérios: 1) ausência de qualquer contaminação visível por agentes fúngicos e bacterianos, 2) evidência de efeito citopático nas amebas devido aos vírus e 3) fase pré-lítica e arredondamento das amebas (para evitar a aspiração de partículas virais).
3. Monte uma estação de trabalho com os seguintes materiais (Figura 1A,B):Micromanipulador, que permite o posicionamento da microcapilar;Dispositivo manual de controle de pressão, usado para aspirar e liberar as células na microcapilar;Microscópio invertido;Módulos motores plug and play;Câmera;Módulo de computador para visualizar a manipulação e tirar fotos.
4. Escolha uma microcapilar (Figura 1C).
   NOTA: O tamanho das células, a deformação e adesão de suas membranas às superfícies, e a motilidade celular podem impactar o bom andamento da microaspiração. O diâmetro da microcapilar pode ser precisamente escolhido e adaptado a tipos celulares específicos conforme seu tamanho e método de aspiração. Uma microcapilar com diâmetro interno de 20 µm foi usada para aspirar uma ameba arredondada (diâmetro ~10 µm). Isso permite manter uma posição interna adequada e uma liberação fácil da célula.
5. Monte o sistema.
   1. Fixe o ângulo de operação do sistema de fixação no módulo motorizado em 45°.
   2. Realize uma instalação dupla, primeiro no sistema de fixação e depois na microcapilar.
   3. Foque nas células após passar algumas gotas de óleo pela microcapilar.
      NOTA: O óleo mineral com compatibilidade biológica é fornecido pelo equipamento.
   4. Complete a montagem seguindo as recomendações do fabricante.
6. Clone as células (Figura 2A,B)
   1. Coloque a placa de Petri contendo 2 mL de amebas infectadas sob o microscópio.
   2. Foque primeiro nas células e depois na microcapilar imersa na cultura.
   3. Escolha uma célula única arredondada e aproxime a microcapilar do micromanipulador.
   4. Exerça uma aspiração suave com controle manual de pressão sobre a célula, introduzindo-a na microcapilar. Remova a célula isolada da primeira amostra e libere-a no suporte celular, depois incube-a a 30 °C.
   5. Realize observações diárias com microscópio óptico invertido para acompanhar a aparência das células e monitorar o surgimento do efeito citopático.

Tabela 1: Composição dos meios de cultura

Resultados

Figura 1: Materiais para micromanipulação. (A) Configuração real da estação de trabalho. (B) Ilustração esquemática dos componentes da estação de trabalho. (C) Ilustração esquemática da microcapilar.

Figura 2: Etapas da microaspiração. (A) Procedimento de isolamento de célula única (ampliação x40). (B) Ilustração esquemática das diferentes etapas da aspiração de célula única: 1) Localização da célula. 2) Aspiração da célula. 3) Etapa de liberação. As setas pretas indicam a microcapilar e as brancas indicam a célula única.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de cultura celular Corning de 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	Cultivo
Frascos de cultura celular Corning de 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	Cultivo
Frascos de cultura celular Corning de 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	Cultivo
Câmera DFC 425C	LEICA	Unkown	Observação/Monitoramento
Microscópio invertido Eclipse TE2000-S	Nikon	Unkown	Observação/Monitoramento
Microcapilar de 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiração e liberação de células
Micromanipulador InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Posicionamento do microcapilar
Placa de Petri de 35 mm	Ibidi	81158	Cultivo/observação