Triagem Baseada em Fluorescência de Partículas Virais Individuais para Análise Genômica

Resumo

Fonte: Zeigler Allen, L., et al. Isolamento e Análise Genômica de Viriões Individuais utilizando a 'Genômica de Vírus Individual'. J. Vis. Exp. (2013).

Este vídeo demonstra como a citometria de fluxo permite o isolamento de vírus individuais, contendo genoma, de populações mistas por meio da detecção baseada em fluorescência e ordenação precisa de partículas, seguida de inclusão em agarose para caracterização genômica subsequente.

Protocolo

1. Preparação de Suspensões Virais

Antes do isolamento de vírions individuais por citometria de fluxo, prepare suspensões virais não fixadas.

1. Isole partículas virais utilizando protocolos previamente estabelecidos, garantindo que a suspensão viral final esteja contida em TE (Tris-EDTA, pH 8) filtrado em 0,1 μm. Recomendamos o uso de abordagens de filtração tangencial de fluxo (TFF), embora outros métodos tenham sido desenvolvidos que utilizam floculação química.
2. Conte as partículas virais utilizando protocolos estabelecidos, por exemplo, usando epifluorescência 8-10 ou citometria de fluxo.
3. Aliquote a suspensão viral em dois tubos Eppendorf (recomenda-se um volume final de 1.000 μl).

2. Citometria de Fluxo

1. Para classificar vírus utilizando o citômetro de fluxo BD FACSAria II equipado com um PMT personalizado de dispersão para frente (FSC PMT), dilua as partículas virais em 0.1 μm-filtrado TE, pH 8,0, até uma titulação apropriada para uma taxa de eventos de 200 eventos por segundo^-1.
2. Defina os limiares para maximizar as relações sinal-ruído, por exemplo, para um conjunto misto contendo partículas de fago T4 e fago lambda, recomenda-se o seguinte: FSC PMT em 1.000 e SSC em 200.
3. Executar 100 μl de "em branco" amostras contendo apenas 1) 0.1 μm-TE filtrada e 2) 0.1 μmTE filtrado em 0,1 μm e SybrGreen1 na diluição de 1e-4 do estoque (10.000X).
4. Execute uma pequena alíquota (100 μl é recomendado) de suspensão viral não corada para avaliar o fundo, seguido pela suspensão viral corada (SybrGreen1 na diluição de 1e-4 do estoque), com partículas virais até um total de 5.000 eventos cada. Isso serve para verificar a concentração e ajustar as janelas de separação, se necessário, antes da separação. Recomendamos uma janela estreita no centro das partículas virais. Além disso, para gerar as janelas, utilizamos o gráfico de SYBR Green e FSC PMT.
5. Adicionar 5 μl de agarose de ponto de fusão baixa (LMP) a 1% (em tampão TBE) resfriada a 37 °C em cada poço de uma lâmina de microscopia de politetrafluoretileno (PTFE) (Electron Microscopy Sciences).
6. Carregue a lâmina de microscopia de politetrafluoretileno (PTFE) no citômetro de fluxo para capturar as partículas virais classificadas.
7. Inicie a separação de partículas virais coradas com SYBR green diretamente sobre a lâmina de politetrafluoretileno (PTFE) com agarose de ponto de fusão baixa (LMP). Recomendamos separar 10 ou mais eventos (partículas virais) em alguns poços para auxiliar na detecção da profundidade dos vírus durante a microscopia de varredura a laser confocal (CSLM).
8. Quando a classificação estiver concluída, remova a lâmina do citômetro de fluxo e adicione 5 μl mais agarose de ponto de fusão baixo resfriada a 37 °C em cada poço, incorporando assim a(s) partícula(s) viral(is).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão TE 1X	Invitrogen	12090-015
Fenol saturado com tampão	Invitrogen	15513-039
Agarose de ponto de fusão baixo (LMP)	Invitrogen	16520100
Lâmina microscópica de politetrafluoroetileno (PTFE)	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 poços, diâmetro de 4 mm
β-agarase	New England Biolabs	M0392S