Enriquecimento de Vírus Gigantes Baseado em Amebas a partir de uma Amostra Ambiental de Água

Resumo

Fonte: Bou Khalil, J. Y.,et al. Uma Estratégia Rápida para o Isolamento de Novos Faustovírus a Partir de Amostras Ambientais Utilizando Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o enriquecimento de vírus gigantes a partir de uma amostra ambiental de água utilizando co-cultivo baseado em amebas para permitir a detecção e análise posteriores.

Protocolo

1. Coleta de Amostras

1. Colete 70 amostras de diferentes ambientes e regiões. Neste caso, utilize as seguintes: 5 amostras de água suja do vilarejo de Saint Pierre de Meyzoargues (França), 15 amostras do lago no Parc Borély em Marselha (França); 15 amostras de água do mar com sedimento das enseadas rochosas em Samena em Marselha (França), 25 amostras de água de rio dos Alpes (França) e, finalmente, 10 amostras de esgoto de La Ciotat (França).
2. Vortex as amostras para homogeneização antes da inoculação, durante um minuto à temperatura ambiente sem qualquer tratamento.

2. Procedimento de Isolamento

1. Preparação do Hospedeiro para Procedimentos de Cultura Cega e Inoculação de Amostras
   1. Utilize Vermamoeba vermiformis (estirpe CDC19) como suporte celular para a co-cultura.
   2. Mantenha as amebas a 28 °C, em um frasco de cultura celular de 75 cm² com 30 ml de meio de protease-peptona-extrato de levedura-glicose (PYG). Verifique a composição do PYG na Tabela 1.
      NOTA: Após 48 h, as amebas são quantificadas por contagem convencional utilizando lâminas de contagem (por exemplo, Kovaslides).
   3. Recolha as células numa concentração de 5 x 10⁵ a 10⁶ células/ml e pelletize as amebas por centrifugação a 720 x g durante 10 min.
   4. Remova o sobrenadante por aspiração e re-suspenda o pellet de amebas em 30 ml de solução salina amebiana estéril de Page (PAS) Tabela 1. Repita este procedimento de lavagem.
   5. Re-suspenda as amebas em 30 ml de meio de inanição contendo uma mistura de antibiótico e antifúngico numa concentração de aproximadamente 10⁶ amebas/ml. O meio de inanição é um meio de sobrevivência para a ameba, permitindo que permaneça viva sem sofrer encistamento ou multiplicação. Verifique a composição na Tabela 1.
      NOTA: A mistura de agentes antimicrobianos continha 10 µg/ml de vancomicina, 10 µg/ml de imipenem, 20 µg/ml de ciprofloxacina, 20 µg/ml de doxiciclina e 20 µg/ml de voriconazol. Esta mistura teve como finalidade reduzir a contaminação bacteriana e fúngica que pode diminuir ou alterar a multiplicação viral.
   6. Inocule diretamente 25 µl de cada amostra sobre a monocamada de 200 µl de amebas em uma placa de 96 poços com fundo plano, que favorece a aderência das amebas, e incube a 30 °C em ambiente úmido (um ambiente úmido consiste em colocar uma compressa úmida dentro do saco que contém a placa, a fim de evitar evaporação). Esta é a cultura primária. Deixe dois poços com amebas sem inoculação de amostra; isso serve como controle negativo. Incube esta cultura primária por três dias.
   7. Três dias após a primeira inoculação, subcultive a placa da cultura primária em amebas frescas conforme descrito acima, sem qualquer observação microscópica. Incube a nova placa por três dias nas mesmas condições da cultura primária.
   8. Realize a cultura final após esses três dias de incubação, da mesma forma que para as culturas primária e secundária. Incube a cultura final por dois dias. Em seguida, prossiga para a detecção.

Tabela 1. Receitas das soluções

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio protease-peptona-extrato de levedura-glicose (PYG), solução salina amebiana de Page (PAS), meio de inanição	Produção interna do laboratório	Marseille URMITE	x
Estirpe de ameba CDC-19	ATCC	França	50237
Placas	Cellstar	França	655180
Frascos	SARSTEDT	Alemanha	833911
Ultracentrífuga Sorval WX 80	Thermo scientific	França	9102448