Quantificação do Vírus da Hepatite C Infeccioso por Microscopia de Fluorescência

Resumo

Fonte: Ren, S., et al. Um Protocolo para Analisar a Replicação do Vírus da Hepatite C. J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo demonstra o ensaio de focos de fluorescência utilizado para quantificar o vírus da hepatite C infeccioso em cultura celular. Ele mostra a diluição seriada do sobrenadante viral, a infecção de células de hepatoma e a detecção de sítios de replicação viral por meio de microscopia de fluorescência baseada em anticorpos.

Protocolo

1. Medição do Título Viral

1. Plaque células Huh-7.5.1 ingênuas em aproximadamente 3 x 10³ células/poço usando uma placa de 96 poços. No dia seguinte, realize diluições seriadas de 10 vezes do sobrenadante de cultura livre de células colhido de células transfectadas com RNA do vírus da hepatite C (HCV) usando meio de crescimento e inocule em triplicata sobre células Huh-7.5.1.
2. Fixe as células 72 horas após a infecção usando metanol (por 30 minutos a -20 ºC) e imunomarque para a proteína NS5A do HCV.
3. Lave as células com PBS três vezes e bloqueie com tampão bloqueador para IFA.
4. Use anticorpo primário policlonal de coelho anti-NS5A ou anticorpo monoclonal de camundongo anti-RNA de cadeia dupla J2 em uma diluição de 1:200 (1 μg/ml) e incube de 5 horas a durante a noite a 4 ºC.
5. Lave as células com PBS três vezes após o anticorpo primário.
6. Adicione anticorpo secundário policlonal de cabra anti-IgG de coelho-488 ou anticorpo secundário policlonal de cabra anti-IgG de camundongo-594 em uma diluição de 1:1.000 (1 μg/ml) e incube por 1 hora à temperatura ambiente.
7. Lave as células com PBS três vezes e visualize usando um microscópio de fluorescência.
8. Use a diluição mais alta para contar os focos positivos para NS5A e calcule o número médio de unidades formadoras de foco (FFU) por mililitro. Veja Figura 1 para o título do HCV.

Resultados

Figura 1. Análise da infectividade do HCV selvagem e medição do título viral. A) Células Huh-7.5.1 ingênuas foram utilizadas para estudos de infecção. O sobrenadante livre de células coletado às 48 e 96 horas pós-transfecção (hpt) do RNA do HCV foi submetido a diluições seriadas de 10 vezes e adicionado às células em uma placa de 96 poços em triplicata. Após 72 horas de infecção, as células foram fixadas e imunomarcadas para a proteína NS5A do HCV. As células com coloração positiva para NS5A (vermelho) estão infectadas com o vírus. Para avaliação da Unidade Formadora de Focos (FFU), os focos positivos na maior diluição foram contados. Painéis representativos de imagens são mostrados (Barra de escala: 100 μm). B) Os valores médios e os desvios-padrão do título viral em FFU por mililitro são apresentados no gráfico. O mutante nulo da polimerase não produziu partículas infecciosas. WT: selvagem; Pol-: nulo da polimerase.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		A linhagem celular foi gentilmente cedida pelo Dr. Francis Chisari ao Dr. Arumugaswami mediante acordo de MTA executado entre The Scripps Research Institute e Cedars-Sinai Medical Center
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-RNA de dupla fita J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020