Este vídeo demonstra o uso da química click e da microscopia de fluorescência para visualizar a transcrição de RNA recém-sintetizado em células de mamíferos. Ele destaca como a infecção viral suprime a transcrição do hospedeiro por meio da comparação de sinais fluorescentes entre células infectadas e células controle.
Artigo de método
Visualização da Supressão Transcricional em Células Infectadas por Vírus
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30 de setembro de 2026
Neste artigo
Resumo
Protocolo
Infecte células com o vírus da febre do Rift Valley (RVFV) cepa MP-12 e marque o RNA recém-sintetizado com 5-etiniluridina (EU)
- Plaque células de rim embrionário humano 293 (HEK293) em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços com meio de crescimento (meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina). Incube em um incubador umidificado a 37 °C e 5% de CO2 até que as células atinjam 80 - 100% de confluência.
- Infecte as células com MP-12 com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3. Inclua pelo menos dois poços não infectados: um dos poços servirá como controle não infectado, e o outro será tratado com actinomicina D (ActD). Remova o meio de crescimento e dilua o estoque viral de modo que o volume total adicionado a cada poço seja de 400 μL. Incube por 1 hora em um incubador umidificado a 37 °C e 5% de CO2.
- Remova o inóculo e adicione 2 mL de meio de crescimento fresco por poço. Incube a 37 °C por 12 horas.
NOTA: Caso adapte este protocolo para uso com outro vírus, recomenda-se realizar um experimento de curso temporal para determinar o ponto ideal de marcação e coleta. Configure este curso temporal de modo que os tempos de infecção sejam escalonados e todas as amostras possam ser marcadas, coletadas e coradas ao mesmo tempo.
- Aos 12 horas pós-infecção (hpi), substitua o meio de crescimento por um meio contendo 0,5 mM de EU. Em um dos poços mock-infectados, adicione também 5 μg/mL de ActD. Este poço servirá como controle de supressão da transcrição, já que a ActD inibe a síntese de RNA dependente de DNA. Retorne as células ao incubador.
- Aos 13 hpi, lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e colete-as por tripsinização. Lave as células coletadas três vezes com PBS contendo 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).
NOTA: Durante esta e as etapas subsequentes, não centrifugue as células a mais de 500-1.000 x g para evitar a ruptura celular. Centrifugue as células por 1-2 minutos para sedimentação.
NOTA: Se for planejada imunomarcação de superfície após a reação de "click", colete as células usando um raspador de borracha ("rubber policeman") ou raspador celular descartável.
- Fixe as células ressuspendendo-as em 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) e incube por 30 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Lave uma vez com 1 mL de PBS-EDTA por poço. Prossiga imediatamente para a etapa 2.
NOTA: É importante prosseguir imediatamente com a reação de "click", pois o RNA se degrada se mantido nesta etapa por períodos prolongados. Da mesma forma, se estiver realizando um experimento de curso temporal, certifique-se de marcar, fixar e corar todas as amostras ao mesmo tempo.
Reação de "Click" para Detectar o RNA Marcado
- Permeabilize as células adicionando 1 mL de Triton X-100 a 0,2% em PBS. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
NOTA: Todas as soluções utilizadas nas etapas 2.1 a 2.3 devem ser livres de nucleases.
- Lave três vezes com 1 mL de PBS por poço.
- Remova as lamínulas da placa de 12 poços e transfira-as para uma câmara umidificada. Cubra cada lamínula com 50 - 100 μL de solução de coloração de "click" (Tris 100 mM pH 8,5, CuSO4 1 mM, azida fluorescente 20 μM [máximo de excitação/emissão: 590/617 nm], ácido ascórbico 100 mM). Incube por 1 hora à temperatura ambiente no escuro.
NOTA: Para montar a câmara umidificada, forre o fundo de uma placa de cultura celular ou placa de Petri de 10 cm de diâmetro com filme plástico de parafina. Forre a borda interna do recipiente com toalhas de papel umedecidas. Coloque as lamínulas sobre o filme plástico de parafina.
NOTA: Tenha cuidado para que as lamínulas não sequem durante esta ou qualquer outra etapa do protocolo. O ideal é adicionar a solução de coloração a cada lamínula imediatamente após sua colocação na câmara umidificada.
NOTA: Prepare a solução de coloração de "click" fresca imediatamente antes desta etapa. Soluções estoque de Tris 1,5 M pH 8,5, CuSO4 100 mM e ácido ascórbico 500 mM podem ser armazenadas a 4 °C. No entanto, descarte qualquer solução estoque de ácido ascórbico que tenha ficado amarelada.
NOTA: Certifique-se de escolher um fluoróforo compatível com os filtros do seu microscópio de fluorescência.
- Remova as lamínulas da câmara umidificada e coloque-as em uma placa de 12 poços nova, lavando três vezes com 1 mL de PBS por poço.
- Monte as lamínulas colocando uma gota (aproximadamente 15 μL) de Fluoromount-G em uma lâmina de microscopia. Mergulhe a lamínula em H2O, remova o excesso de H2O tocando a lateral em uma toalha de papel e posicione o lado das células para baixo na gota de Fluoromount-G. Deixe secar ao ar por 5 minutos.
NOTA: Se for realizar a imagem em um microscópio invertido, deixe o Fluoromount-G solidificar a 4 °C durante a noite ou fixe as lamínulas à lâmina de microscopia selando as bordas com esmalte transparente.
NOTA: As lâminas podem ser analisadas imediatamente ou armazenadas a 4 °C no escuro por até uma semana.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5-Etinil uridina | Berry Associates | PY 7563 | Dissolver em DMSO para estoque de 100 mM |
| Cobrislides redondos de 12 mm | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| Actinomicina D (ActD) | Sigma | 9415 | Dissolver em DMSO para estoque de 10 mM |
| Microscópio de fluorescência | por exemplo, Olympus IX71 | ||
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | Dissolver em H₂O para estoque de 100 mM |
| DMEM (meio Eagle modificado de Dulbecco) | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS (soro bovino fetal) | Invitrogen | 16000044 | |
| Azida fluorescente (acoplada ao Alexa Fluor 594) | Invitrogen | A10270 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A-5960 | Dissolver em H₂O para 500 mM |
| Paraformaldeído | Sigma | 158127 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Base de Trizma | Sigma | T-1503 | dissolver em H₂O para estoque de 1,5 M, pH 8,5 |
