Análise da Supressão Transcricional do Hospedeiro Induzida por Vírus Utilizando Citometria de Fluxo

Resumo

Fonte: Kalveram, B., et al. Uso da Química Click para Medir o Efeito da Infecção Viral na Síntese de RNA da Célula Hospedeira. J. Vis. Exp. (2013)

Este vídeo demonstra o uso da química click e da citometria de fluxo para medir a supressão da transcrição nas células hospedeiras induzida por vírus. Células de mamíferos são infectadas com um vírus que expressa uma proteína de virulência nuclear que interrompe o complexo de fatores de transcrição do hospedeiro, enquanto as células controle permanecem ativas na transcrição. A incorporação de 5-etiniluridina marca o mRNA recém-sintetizado, permitindo a quantificação da atividade transcripcional em células infectadas e controle por meio da detecção de dupla fluorescência.

Protocolo

1. Infectar Células com MP-12 e Marcar o RNA Recém-Sintetizado com 5-etiniluridina (EU)

1. Plaque células 293 em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em meio de crescimento (DMEM contendo 10% de soro bovino fetal, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina). Incube em um incubador umidificado a 37 °C e 5% de CO₂ até que as células atinjam 80 - 100% de confluência.
2. Infete as células com MP-12 a uma m.o.i. de 3. Inclua pelo menos dois poços não infectados: um dos dois poços servirá como controle não infectado, e o outro será tratado com ActD no passo 1.4. Remova o meio de crescimento e dilua o estoque viral de modo que o volume total adicionado a cada poço seja de 400 μl. Incube por 1 hora em um incubador umidificado a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Remova o inóculo e adicione 2 ml de meio de crescimento fresco por poço. Incube a 37 °C por 12 horas.

NOTA: Caso adapte este protocolo para uso com outro vírus, é aconselhável realizar um experimento de curso temporal para determinar o ponto ideal de tempo para marcação e coleta. Configure este curso temporal de forma que os tempos de infecção sejam escalonados e todas as amostras possam ser marcadas, coletadas e coradas ao mesmo tempo.

4. Após 12 h.p.i., substitua o meio de crescimento por um meio contendo 0,5 mM de EU. Em uma das amostras controle não infectadas, adicione também 5 μg/ml de ActD. Isso servirá como controle para supressão da transcrição, já que a ActD inibe a síntese de RNA dependente de DNA. Retorne as células ao incubador.
5. Após 13 h.p.i., lave as células uma vez com PBS e recolha-as por tripsinização. Lave as células recolhidas três vezes com PBS contendo 1 mM de EDTA (PBS-EDTA).

NOTA: Durante este e os passos subsequentes, não centrifugue as células a mais de 500 - 1.000 x g para evitar a ruptura celular. Centrifugue as células por 1-2 min para sedimentação.

NOTA: Se uma imunomarcação de superfície for planejada após a reação de click, realize a colheita usando espátula de borracha ou escovelo descartável.

6. Fixe as células ressuspendendo-as em 1 ml de PFA a 4% e incube por 30 min à temperatura ambiente.
7. Lave uma vez com 1 ml de PBS-EDTA por poço. Prossiga imediatamente para a etapa 6.

NOTA: É importante prosseguir imediatamente com a reação de click, pois o RNA se degrada se mantido nesta etapa por períodos prolongados. Da mesma forma, se estiver realizando um experimento de curso temporal, certifique-se de rotular, fixar e corar todas as amostras ao mesmo tempo.

2. Reação de Clique para Detectar RNA Marcado

1. Permeabilize as células ressuspendendo-as em 0,5 ml de Triton X-100 0,2% em PBS. Incube por 10 min a RT.

NOTA: Todas as soluções utilizadas nas etapas 2.1 a 2.3 precisam ser livres de nucleases. Se as células não sedimentarem adequadamente durante esta etapa, aumente o tempo de centrifugação para 5 min. O comportamento de sedimentação melhorará quando as células forem suspensas no tampão FACS.

2. Lave uma vez com 1 ml de PBS.

NOTA: Não use EDTA nesta etapa, pois isso irá quelar os íons Cu²⁺ necessários para a reação de click.

3. Resuspenda as células em 200 μl de solução de marcação por click (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 200nM de azida marcada com corante fluorescente [máximo de excitação/emissão: 650/665 nm], 100 mM ácido ascórbico). Incube por 1 h à temperatura ambiente, no escuro.

NOTA: Prepare a solução de coloração por "click" fresca imediatamente antes desta etapa. Soluções estoque de Tris 1,5 M pH 8,5, CuSO₄ 100 mM e ácido ascórbico 500 mM podem ser armazenadas a 4 °C. No entanto, descarte qualquer solução estoque de ácido ascórbico que tenha ficado amarelada. Se as células aglomerarem durante esta etapa, ressuspenda-as pipetando para cima e para baixo várias vezes. Certifique-se de escolher um fluoróforo que possa ser detectado pelo seu citômetro de fluxo. Prepare também uma amostra de células infectadas que não será submetida ao procedimento de coloração por "click"; essas serão necessárias para a calibração do citômetro de fluxo. Use metade das células infectadas ou inclua um poço adicional infectado na etapa 1.2.

Lave duas vezes com tampão FACS (PBS contendo 1 mM de EDTA e 0,5% (p/v) de BSA).

3. Imunofluorescência para Detectar a Expressão de Proteínas Virais

1. Re-suspenda as células em 200 μl de anticorpo primário (anti-RVFV) diluído em tampão FACS (1:10.000) e incube por 1 h à temperatura ambiente no escuro.

NOTA: Alternativamente, este passo pode ser realizado durante a noite a 4 °C no escuro.

NOTA: Prepare também uma amostra de células não infectadas que foram submetidas ao procedimento de marcação por reação de clique, mas que não serão imunomarcadas; essas serão necessárias para a calibração do citômetro de fluxo. Utilize metade das células mock infectadas ou inclua um poço adicional não infectado no passo 1.2.

NOTA: Ao adaptar este protocolo para uso com um vírus diferente, determine primeiro a diluição ideal para seu anticorpo primário.

2. Lave as células duas vezes com o tampão FACS.
3. Resuspenda as células em 200 μl de anticorpo secundário (IgG anti-murino conjugado com corante fluorescente [máximo de excitação/emissão: 495/519 nm]) diluído no tampão FACS (1:1.000) e incube por 1 h à temperatura ambiente no escuro.
4. Lave as células uma vez com o tampão FACS.

NOTA: Neste ponto, as células podem ser armazenadas O/N a 4 °C no escuro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-etinil-uridina	Berry Associates	PY 7563	dissolver em DMSO para estoque de 100 mM
cobrecopos redondos de 12 mm	Fisherbrand	12-545-82
tubos de poliestireno de 5 ml	BD Biosciences	352058
Actinomicina D (ActD)	Sigma	9415	dissolver em DMSO para estoque de 10 mM
Alexa Fluor 488 anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo	Invitrogen	A-11029
Albumina Sérica Bovina (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	dissolver em H2O para estoque de 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	dissolver em H2O para estoque de 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
azida fluorescente (acoplada ao Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
azida fluorescente (acoplada ao Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
ácido L-ascórbico	Sigma	A-5960	dissolver em H2O para 500 mM
filtro de papel	VWRbrand	28333-087
paraformaldeído	Sigma	158127
Penicilina-Estreptomicina	Invitrogen	15140122
poli-L-lisina (PM ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
base de Trizma	Sigma	T-1503	dissolver em H2O para estoque de 1,5 M, pH 8,5
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200056
Microscópio de Fluorescência			por exemplo, Olympus IX71
Citômetro de Fluxo			por exemplo, BD Biosciences LSRII Fortessa