Produção de Partículas Retrovirais para Transferência Gênica

Resumo

Fonte: Zjablovskaja, P., et al., Proliferação e Diferenciação de Precursores Mieloides Murinos 32D/G-CSF-R. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a produção de partículas retrovirais recombinantes por meio da transfeção de células empacotadoras derivadas de rim humano, permitindo a entrega estável de genes a células-alvo para aplicações posteriores, como modificação genética, ensaios funcionais ou estudos de diferenciação de linhagem.

Protocolo

1. Produção de retrovírus
   1. Plaqueie uma suspensão simples de células Bosc23 (6 × 10⁶) em uma placa de Petri de 16 cm e cultive em 18 mL de DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) contendo 10% de FBS (soro bovino fetal) até que a confluência do cultivo atinja 80% (24 h).
      NOTA: As células devem crescer em monocamada e não formar agregados em cultura. A contagem celular pode ser realizada por diferentes métodos (válido para o restante dos protocolos apresentados aqui). Em caso de um número baixo de amostras, recomenda-se a contagem manual ao microscópio utilizando a câmara de Bürker. Nesse caso, utilize azul de tripano para exclusão de células mortas. Misture as células em proporção 1:1 com azul de tripano 0,4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato). Para realizar a contagem de um grande número de amostras, pode-se utilizar um contador celular automático.
   2. Combine 40 µg do construto retroviral (como MSCV), 20 µg de pCL-Eco (vetor de empacotamento), 80 µl de PEI (polietilenimina) e 2 mL de meio com soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM (Meio Essencial Mínimo) (sem antibióticos). Incube essa mistura por 20 min à temperatura ambiente (RT).
   3. Substitua cuidadosamente o meio das células Bosc23 por 16 mL de DMEM suplementado com 2% de FBS. Pré-aqueça o meio a 37 °C antes do uso.
      NOTA: Não utilize antibióticos durante a transfeção, pois eles podem reduzir a eficiência da transfeção.
   4. Adicione a mistura preparada no passo 1.2 gota a gota e cuidadosamente ao cultivo de Bosc23 e incube por 4 h a 37 °C. Limite a incubação a menos de 6 h devido à toxicidade do PEI.
   5. Após a incubação, troque o meio das células Bosc23 por 18 mL de DMEM pré-aquecido contendo 10% de FBS e cultive as células por 48 h a 37 °C. Coloque as placas em um laboratório de nível de biossegurança 2 e siga os procedimentos padrão de segurança.
   6. Colete o meio das células Bosc23 (contendo partículas retrovirais ecotrópicas) utilizando uma pipeta serológica de 25 mL em um tubo cônico de 50 mL e armazene a 4 °C.
      NOTA: (Importante) A eficiência de transfeção deve atingir 90% para produzir um vírus de alto título.
   7. Adicione 18 mL de DMEM com 10% de FBS pré-aquecido às células Bosc23 e cultive por 24 h.
   8. Repita o passo 1.6.
      NOTA: Os sobrenadantes retrovirais dos passos 1.6 e 1.8 podem ser combinados assim que atingirem a mesma temperatura (4 °C) para preservar a integridade viral.
   9. Para evitar contaminação por Bosc23 nos sobrenadantes virais, centrifugue o vírus coletado a 1500 × g por 10 min a 4 °C. Aliquote o vírus, congele rapidamente utilizando gelo seco ou nitrogênio líquido e armazene a -80 °C. No entanto, observe que o vírus recém-preparado apresenta maior qualidade em termos de eficiência de infecção do que os estoques congelados.
      NOTA: (Importante) Evite ciclos repetidos de congelamento/descongelamento do vírus, pois isso leva à sua degradação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - Meio com redução de soro	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	L-Glutamina, vermelho de fenol
Soro bovino fetal (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	Utilizado para o cultivo de células HEK293T, NIH3T3 e BOSC23
Penicilina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
Estreptomicina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	Pó de sal sulfato de estreptomicina
Gentamicina	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
Polietilenimina	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	Linear, MM 25.000 (PEI 25000)