Geração de Vírus Sincicial Respiratório Recombinante Marcado com GFP Utilizando um Sistema de Expressão T7

Resumo

Fonte: Bouillier, C. et. al., Amplificação e Titulação de Vírus Sincicial Respiratório Recombinantes. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a geração de um vírus sincicial respiratório recombinante que expressa a proteína verde fluorescente (GFP) utilizando um sistema de genética reversa baseado em T7. A co-transfecção de plasmídeos que codificam proteínas virais e um genoma marcado com GFP leva à expressão proteica e inicia o resgate do vírus.

Protocolo

1. Resgate e Primeira Passagem do Vírus Recombinante

NOTA: Realize todos os passos a seguir em um ambiente estéril, utilizando uma cabine de segurança classe II.

1. No dia anterior à transfeção, prepare uma suspensão da linhagem celular BSRT7/5 a 5 x 10⁵ células/mL em meio completo. Distribua 2 mL de suspensão celular por poço em uma placa de 6 poços. Prepare um poço para cada vírus a ser recuperado e um poço adicional para um controle negativo. Incube a placa a 37 °C e 5% CO₂. Verifique se as células estão com uma confluência de 80%–90% no dia seguinte.
2. Descongele os vetores de genética reversa do vírus respiratório sincicial (RSV) p-RSV-GFP e p-RSV-M2-1-GFP, bem como p-N, p-P, p-L e p-M2-1. Para cada vírus a ser recuperado, misture em um tubo 1 µg de p-N e p-P, 0,5 µg de p-L, 0,25 µg de p-M2-1 e 1,25 µg de p-RSV (GFP ou M2-1 GFP).
   NOTA: Podem ser utilizados diferentes vetores de expressão para as proteínas virais do complexo da polimerase (N, P, L e M2-1); no entanto, a proporção entre as proteínas deve ser mantida. Realize o controle negativo substituindo o vetor p-RSV por um vetor vazio.
3. Prossiga para a transfeção (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Adicione 250 µL de meio com soro reduzido aos vetores misturados. Em outro tubo, dilua 10 µL do reagente de transfeção em 250 µL de meio com soro reduzido. Vortexe suavemente ambos os tubos e aguarde 5 min. Misture o conteúdo dos dois tubos e aguarde 20 min à temperatura ambiente.
   2. Lave as células BSRT7/5 com 1 mL de meio com soro reduzido e distribua 1,5 mL de meio essencial mínimo (MEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) sem antibióticos por poço. Se necessário, incube a 37 °C e 5% CO₂ até a conclusão da incubação descrita no passo 1.3.1.
   3. Adicione 500 µL da mistura de transfeção preparada no passo 1.3.1 a um poço quando o tempo de incubação de 20 min terminar. Coloque as células no incubador a 37 °C e 5% CO₂ por 3 dias. Não troque o meio de cultura das células durante a transfeção.
4. Observe a fluorescência da proteína verde fluorescente (GFP) (excitação em 488 nm e emissão em 515–535 nm) em microscópio de fluorescência invertido com aumento de 20x uma vez ao dia para monitorar a eficiência de recuperação, utilizando o filtro GFP.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BSRT7/5		não disponível comercialmente	Consulte a referência 22. Buchholz et al. 1999
Microscópio de fluorescência para observações	Olympus	IX73 Olympus microscope
Microscópio de fluorescência para videomicroscopia	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99,5%	Sigma	H3375
L-Glutamina (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
Reagente Lipofactamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	O protocolo no passo 2.3. é otimizado para este reagente.
MEM (10x), sem glutamina	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, suplemento GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
Reagente MgSO4, ≥99,5%	Sigma	M7506
Meio com soro reduzido Opti-MEM I	ThermoFisher Scientific	51985-026
Plasmídeos		não disponível comercialmente	Consulte a referência 21. Rameix-Welti et al. 2014