Ensaio de Titulação por Placas para Quantificação de Vírus Sincicial Respiratório Infeccioso

Resumo

Fonte: Bouillier, C., et al. Geração, Amplificação e Titulação de Vírus Sinciciais Respiratórios Recombinantes. J. Vis. Exp. (2019)

O vídeo demonstra um ensaio de titulação por placas utilizado para quantificar o vírus respiratório sincicial recombinante (RSV) infeccioso em monocamadas de células epiteliais. Ele apresenta a infecção de células hospedeiras com suspensões virais diluídas em série, a restrição da disseminação viral por uma camada semissólida à base de celulose e a formação de placas localizadas a partir dos efeitos citopáticos. O procedimento conclui com coloração, descontaminação e contagem de placas para determinar o título viral e avaliar a infectividade do RSV.

Protocolo

1. Ensaio de Titulação por Placas

1. Prepare placas de 12 poços para titulação no dia anterior à realização do ensaio de titulação (serão necessários seis poços para titular um tubo de vírus). Semeie os poços com 1 mL de células epiteliais humanas tipo-2 (HEp-2) a 5 × 10⁵ células/mL em meio completo.
2. No dia seguinte, prepare uma suspensão estéril de celulose microcristalina (2,4% [p/v] em água) (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Dispersar 2,4 g de pó de celulose microcristalina em 100 mL de água destilada, utilizando um agitador magnético comum, até a dissolução completa do pó (geralmente 4–12 h). Autoclavar a suspensão a 121 °C por 20 min e armazene-o à temperatura ambiente antes do uso.
      OBSERVAÇÃO: Sob tais condições, a suspensão é estável por 1 ano.
   2. Após abrir a solução em um ambiente estéril, armazene-a a 4 °C por 6 meses. Sempre misture a suspensão antes do uso (agitando manualmente ou em vórtex) para garantir que esteja homogênea.
3. Prepare o 2× meios essenciais mínimos (MEM) em ambiente estéril. Dilua o MEM comercial 10× com água estéril e adicione L-glutamina, 1.000 unidades/mL de penicilina e 1 mg/mL de estreptomicina. Agite a diluição vigorosamente e armazene-a em 4 °C.
   OBSERVAÇÃO: Realize os passos 1.4–1.10 em um ambiente estéril utilizando uma cabine de segurança classe II.
4. Prepare seis tubos contendo 900 µL de MEM sem soro fetal bovino (SFB) por vírus a ser titulado (os tubos de titulação). Descongele as alíquotas do vírus, vortexe vigorosamente por 5 s e transfira 100 µL ao primeiro tubo de titulação.
5. Realize uma diluição em dez vezes 6×, conforme a seguir. Adicione 100 μL de vírus para 900 μL do meio no primeiro tubo, coloque a tampa no tubo e misture o conteúdo por vortexagem por alguns segundos. Troque a ponteira na pipeta, adicione 100 µL da primeira diluição para 900 µL do meio no segundo tubo, coloque a tampa no tubo e vortex. Repita o procedimento até o sexto tubo.
   OBSERVAÇÃO: É muito importante trocar a ponteira para cada diluição.
6. Escreva o nome do vírus e as diluições em fator nos poços das placas de 12 poços de HEp-2. Faça uma marcação para identificar a placa e sua tampa, pois elas podem ser separadas durante a coloração (passo 1.9). Remova o meio das placas e distribua 400 µL de uma diluição por poço. Incubar as placas a 37 °C por 2 h, para adsorção do vírus.
   OBSERVAÇÃO: Troque a ponteira da pipeta entre cada inóculo ou prossiga da menor para a maior concentração com a mesma ponteira. Inocule uma série limitada de placas (1 a 2) simultaneamente para evitar o ressecamento das células.
7. Prepare a camada de celulose microcristalina durante a adsorção do vírus (preparação extemporânea). Para obter 100 mL de camada, misture 10 mL de suspensão de celulose microcristalina a 2,4%, 10 mL de 2× MEM, e 80 mL de MEM com 2% de FCS.
   1. Ajuste o pH do 2× Ajuste o MEM para cerca de 7,2 com uma solução estéril de bicarbonato de sódio a 7,5%, conforme indicado pelo indicador de cor. Adicione a suspensão de celulose microcristalina ao MEM e misture vigorosamente.
8. No final da incubação de 2 h, adicione 2 a 3 mL de cobertura a cada poço das placas de 12 poços sem remover o inóculo. Tenha cuidado para evitar a contaminação dos poços adjacentes com inóculos de alto título viral. Incube a placa a 37 °C e 5% CO₂₂ por 6 dias. Não mova a placa e não mova o incubador durante a incubação.
9. Prossiga para a coloração das células, utilizando solução de violeta de cristal (8% violeta de cristal [v/v], 2% formaldeído [v/v] e 20% etanol [v/v] em água).
   1. Proteja a superfície de trabalho da cabine de segurança biológica com uma folha (o violeta cristal cora fortemente as superfícies).
   2. Agite suavemente as placas para remover a camada de celulose microcristalina. Remova os sobrenadantes e lave as células 2 vezes× com 1× solução salina tamponada com fosfato (PBS). Manipule as placas uma por vez para evitar o ressecamento das células. Adicione 1–2 mL da solução de violeta de cristal e aguarde 10–15 min. Remova a solução, que pode ser reutilizada para coloração subsequente de outras placas.
   3. Mergulhe as placas e as tampas em água sanitária fresca por alguns segundos e, em seguida, lave-as cuidadosamente com água da torneira. Observe que as placas e as tampas são descontaminadas pela água sanitária.
   4. Coloque as placas e as tampas sobre toalhas de papel e deixe secar. Seque as placas à temperatura ambiente após a lavagem com água e armazene-as à temperatura ambiente. Para períodos prolongados de armazenamento (meses), mantenha as placas protegidas da luz para preservar a cor. Observe que, se as células perderem a coloração, podem ser novamente coradas com violeta de cristal.
10. Calcule os títulos virais. Conte as placas nos poços das placas secas, que são visíveis a olho nu. Verifique se o número de placas das diferentes diluições é coerente (fator 10 entre cada diluição). Escolha o poço no qual as placas são mais fáceis de contar. Determine o número de placas em relação ao volume do inóculo e à diluição.
    OBSERVAÇÃO: No exemplo fornecido em Figura 1, 21 placas são contadas na diluição 10^-5 diluição. Estes correspondem a um título de

Resultados

Figura 1: Determinação do título do VSR utilizando o ensaio de placa. (A) Resultados do ensaio de titulação por placas em uma placa de 12 poços. São mostrados os seis poços infectados com diluições em série de um mesmo estoque viral. As diluições são indicadas em logaritmo de base 10. Todas as células infectadas com as três primeiras diluições estão destacadas. Os números de placas observados com as diluições de 10^-4, 10^-5 e 10^-6 são consistentes. (B) Ilustração da contagem de placas (números amarelos). A estrela verde indica arranhões na camada celular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de violeta cristal	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), sem glutamina	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, suplemento GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
Solução de bicarbonato de sódio 7,5%	ThermoFisher Scientific	25080094
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122