Avaliação da Capacidade de Replicação Viral Utilizando um Ensaio de Transcriptase Reversa Radiolabelado

Resumo

Fonte: Claiborne, D. T. et al. Um Método de Clonagem Baseado em Enzimas de Restrição para Avaliar a Capacidade de Replicação In vitro de Vírus Quiméricos HIV-1 Subtipo C Gag-MJ4. J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo demonstra a avaliação da capacidade de replicação viral utilizando um ensaio de transcriptase reversa marcado com radiação. Sobrenadantes de cultura contendo viriões descendentes são adicionados a uma mistura de transcrição reversa contendo um nucleotídeo marcado com radiação. O sinal incorporado reflete a produção viral e a eficiência de replicação. A imagem com fósforo é utilizada para detectar e comparar os sinais entre as amostras-teste e as amostras selvagens.

Protocolo

1. Análise da Transcriptase Reversa (RT) em Sobrenadantes de Cultura Celular

1. Configure uma cabine de segurança biológica em uma instalação de nível de segurança biológica 3 (NSB-3) para uso com materiais radioativos.
   1. Coloque papel absorvente na cabine e substitua o aspirador por um aspirador designado para uso com materiais radioativos. 
      NOTA: Todo resíduo radioativo deve ser descartado adequadamente de acordo com as regulamentações de segurança.
2. Adicione 1-2 µl de 10 mCi/ml de trifosfato de desoxitimidina [α-³³P] (dTTP) e 4 µl de 1 M de ditiotreitol (DTT) a cada alíquota de 1 ml da mistura-mãe de RT (ver Tabela 1).
3. Misture cuidadosamente cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo a mistura-mãe de RT, DTT e [α-³³P] dTTP com uma pipeta de 1.000 µl e transfira para um reservatório estéril.
4. Dispense 25 µl da mistura de RT marcada em cada poço de uma placa de reação em cadeia da polimerase (PCR) de 96 poços com paredes finas. 
   NOTA: Inclua espaço para um controle positivo (infecção pelo tipo selvagem MJ4 (WT)) e um controle negativo (infecção simulada).
5. Adicione 5 µl de cada sobrenadante à placa de PCR contendo a mistura-mãe de RT.
6. Selar a placa de PCR com uma tampa adesiva de folha e incubar por 2 h a 37 °C em um termociclador. Por razões de segurança, enxágue as ponteiras de pipeta com Amphyl e descarte as ponteiras em um recipiente pequeno contendo resíduo de Amphyl, que posteriormente será descartado como resíduo radioativo.
7. Após a incubação, faça pequenos furos na tampa de folha usando uma pipeta multicanal de 200 µl. 
   NOTA: Se as ponteiras de pipeta tocarem o líquido no poço, substitua as ponteiras antes de passar para a próxima coluna ou linha.
8. Misture as amostras 5 vezes e transfira 5 µl de cada amostra para o papel DE-81. Deixe secar ao ar por 10 min.
9. Lave as membranas 5 vezes com cloreto de sódio-citrato salino 1x (SSC) e, em seguida, 2 vezes com etanol a 90%, durante 5 min por lavagem. Deixe secar ao ar.
   1. Coloque cada membrana em um recipiente de lavagem separado, como uma caixa de armazenamento tipo sanduíche, adicione volume suficiente de tampão de lavagem (1x SSC ou etanol a 90% (EtOH)) para cobrir a membrana e agite por 5 min.
   2. Despeje o tampão de lavagem em um recipiente separado e repita. NOTA: As primeiras 3 lavagens são consideradas radioativas e devem ser descartadas adequadamente. As últimas 2 lavagens podem ser descartadas normalmente.
10. Quando estiverem secas, envolva cuidadosamente as membranas em filme plástico e exponha a uma tela fosforescente em um cassete hermeticamente fechado durante a noite à temperatura ambiente.
11. Analise as telas fosforescentes com um fosfoimager e quantifique os transcritos radioativos.
12. Desenhe um círculo ao redor de cada sinal radioativo usando o software OptiQuant. Represente graficamente os valores de Unidade de Luz Digital (DLU) para gerar curvas de replicação.
13. Para gerar os escores de capacidade de replicação, os valores de DLU foram transformados em log₁₀, e as inclinações foram calculadas usando os pontos temporais dos dias 2, 4 e 6. As inclinações de replicação foram então divididas pela inclinação do MJ4 WT para gerar os escores de capacidade de replicação. É importante normalizar com base nos valores do MJ4 WT obtidos da mesma placa de RT para reduzir a variabilidade intraensaio.

Tabela 1: Receita para a mistura mestra do ensaio de transcriptase reversa marcado com radiação.
NOTA: Armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 °C.

Reagente	Volume (ml)
Água livre de nucleases (H2O)	419.5
Tris-Cl, pH 7,8 (1 M)	30
Cloreto de potássio (1 M)	37,5
Cloreto de magnésio (1 M)	2,5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0,5 M)	1,02
Ácido poliadenílico, sal de potássio (2 mg/ml)	1,25
Primer oligo-dT (25 μg/ml)	3,25
Volume total	500

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes para cultura celular
Desinfetante/limpador Amphyl	Fisher	22-030-394
Bandejas reservatório para multicanal, 55 ml	Fisher	13-681-501
Solução de cloreto de magnésio 1 M	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Reagentes para ensaio de quantificação de transcriptase reversa
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
Tris-Cl 1 M, pH 8,0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	Deve ser ajustado para pH 7,8 com KOH
Cloreto de potássio (KCl) 2 M	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	Ajustar para solução 1 M
EDTA 0,5 M	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Sal de potássio do ácido poliadenílico (Poly rA)	Midland Reagent Co.	P-3001
Primer oligo d(T)	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
Tela de fósforo de super-resolução SR, pequena	Perkin-Elmer	7001485
Placa de 96 poços Corning Costar Thermowell modelo (M) de policarbonato	Fisher	07-200-245	Fabricado pela Corning Life
Fita de vedação de alumínio para microplaca de 96 poços Corning, não estéril	Fisher	07-200-684	Fabricado pela Corning Life
Papel de troca aniônica DE-81	Whatman	3658-915
Citrato de trissódio diidratado	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Cloreto de sódio	Fisher	S671-3
Cápsula de autoradiografia	Fisher	FB-CA-810
Tela de fósforo para armazenamento Cyclone	Packard
Ciclador térmico, PTC-200	MJ Research