Preparação de Amostras para Quantificação Viral Baseada em Luciferase

Resumo

Fonte: Garcia, V., et al. Titulação em Alta Vazão de Vírus Recombinantes que Expressam Luciferase. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

Este vídeo demonstra a preparação de amostras de cultura celular para avaliar a carga viral utilizando um ensaio baseado em luciferase. Ele descreve o processo de infecção de células epiteliais com um vírus geneticamente modificado, transferência de sobrenadantes virais e padrões para poços do ensaio, e promoção da entrada viral por meio de centrifugação e incubação. A expressão de luciferase atua como um repórter, permitindo a quantificação da concentração viral com base na emissão de sinal luminiscente.

Protocolo

1. Preparação da Amostra

1. Obtenha amostras contendo vírus que expressam luciferase (aqui, VSV∆51-Fluc como exemplo) para titulação e transfira para placas de 96 poços. Alternativamente, realize infecções em placas de cultura de tecidos de 96 poços e use os sobrenadantes diretamente.
2. Deixe duas colunas sem tratamento para inclusão das curvas-padrão. Para experimentos realizados diretamente em placas de 96 poços, realize a titulação ao final do experimento (40 h pós-infecção) ou armazene a -80 °C e titule em uma data posterior.

2. Preparação de Células Permissivas para Titulação Viral

1. 24 horas antes da titulação, prepare uma suspensão de células Vero numa concentração de 2,5 x 10⁵ células/ml em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), 30 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico (HEPES) e 1% de penicilina/estreptomicina. 
   NOTA: Embora este protocolo utilize células Vero, qualquer linhagem celular permissiva adequada para infecção pelo vírus da estomatite vesicular (VSV) pode ser usada.
2. Plaque 2,5 x 10⁴ células (100 μl) em placas brancas sólidas de fundo plano de 96 poços usando um dispensador de microplacas.
   1. Prepare 12 ml de suspensão celular por placa, mais 5 ml para escorvamento.
   2. Limpe a cassete do dispensador de microplacas lavando os tubos com 50 ml de água estéril.
   3. Encha as linhas do dispensador de microplacas com a suspensão celular e deixe passar 5 ml da suspensão.
   4. Selecione um programa que dispense 100 μl em cada poço de uma placa de 96 poços com paredes brancas. Realize a dispensação e repita conforme necessário para placas adicionais. Além disso, plaque alguns poços em uma placa de 96 poços transparente de fundo plano, caso sejam usadas placas com fundo opaco e paredes brancas, para verificação da saúde e densidade celular.
   5. Quando terminar, recoloque as células no recipiente original. Limpe a cassete passando 50 ml de etanol a 70%, seguido por 50 ml de água estéril morna pelos tubos.
   6. Assegure-se de que a cassete e os tubos sejam adequadamente limpos entre usos.
3. Incube as células por 24 horas a 37 °C em um incubador umidificado com 5% de CO₂.

3. Preparação da Curva Padrão Viral

1. Prepare uma curva padrão de VSV∆51-Fluc em DMEM sem soro de modo que a concentração final de unidades formadoras de placa (pfu) por ml após a transferência para células Vero seja a seguinte: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml e 10¹ pfu/ml. Prepare 50 μl de cada concentração por placa de células Vero, mais 10% extra.
   NOTA: O título do estoque de vírus luciferase precisará ser avaliado de forma clássica para gerar uma curva padrão que permita a quantificação absoluta. Caso contrário, a quantificação relativa pode ser alcançada sem informações precisas de título, definindo-se arbitrariamente o título viral com base nos passos de diluição. Por exemplo, a primeira diluição da curva padrão pode ser definida como 10⁸ unidades virais, e a diluição subsequente de 1/10 como 10⁷, e assim por diante. Nesse contexto, os valores devem ser expressos como uma alteração em relação a uma amostra pré-determinada, já que a quantificação absoluta não será precisa.

4. Transferência de Sobrenadantes de Amostras para Células Permissivas

1. Verifique as células Vero cultivadas na placa de 96 poços com fundo transparente sob microscópio óptico para confirmar que as monocamadas estão com pelo menos 95% de confluência.
2. Transfira 25 μl do sobrenadante da amostra para as células Vero semeadas em placas com paredes brancas. Não transfira sobrenadantes para as 2 colunas designadas para as curvas-padrão. 
   NOTA: Isso pode ser feito simultaneamente em todos os poços de uma única placa utilizando um manipulador líquido de 96 canais.
3. Utilizando uma pipeta multicanal de 8 ou 12 canais, adicione 25 μl de cada diluição da curva-padrão preparada na Etapa 3 às células Vero nas 2 colunas designadas.
4. Centrifugue as placas por 5 min a 430 x g em temperatura ambiente (RT).
5. Incube por 5 hr a 37 °C em um incubador umidificado com 5% de CO₂.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Essencial Modificado de Dulbecco (DMEM)	Corning	SH30243.01
Soro bovino fetal	NorthBio Inc.	NBSF-701
Solução salina tamponada com fosfato	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Preparar uma solução 1 mM, pH 7,3
Placas microplacas de poliestireno tratadas para cultura celular (TC), brancas, de fundo plano e sólido, 96 poços	Corning	3917	Placas de 384 poços também podem ser utilizadas para maior produtividade
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Leitor de microplacas com monocromador
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	Sistema manual de pipetagem com 96 ponteiras
Ponteiras esterilizadas com filtros para Liquidator96 LTS	Mettler Toledo	LQR-200F	Quaisquer ponteiras esterilizadas com filtros compatíveis com os pipetadores escolhidos são adequadas
Microflo	BioTek	111-206-21	Utilizado para semear células em placa de 96 poços
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Fluorímetro de microplacas