Geração de Células-Tronco Embrionárias de Camundongo Infectadas por Lentivírus

Resumo

Fonte: Chiarella, A. M. et. al., Repressão da Transcrição Gênica por Redirecionamento da Maquinaria Celular com Modificadores Epigenéticos Químicos. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a geração de células-tronco embrionárias de camundongo geneticamente modificadas utilizando transdução por lentivírus. Partículas lentivirais entregam um marcador de resistência a antibióticos, permitindo a integração genômica estável e a seleção de células transduzidas.

Protocolo

1. Infecção de Células-Tronco Embionárias de Camundongo (mESC) com Lentivírus

1. Cultive células-tronco embrionárias de camundongo (mESC) de baixa passagem (menos de passagem 35), adaptadas ao ensaio de cromatina in vivo (CiA), em meio-base de Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) com alta concentração de glicose, suplementado com 20% de soro bovino fetal (FBS) de grau para células-tronco embrionárias, 10 mM de 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES), 1x de aminoácidos não essenciais (NEAA), Pen/Strep, 2-mercaptoetanol e fator inibidor de leucemia (LIF) na proporção de 1:500, em incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
   NOTA: O LIF é obtido do sobrenadante de células Cos produtoras de Lif-1C-alpha (COS LIF), que são coletadas em lote e congeladas a -80 °C.
   1. Cultive as células em placas previamente incubadas por 1 a 3 h com 0,1% de gelatina em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) e posteriormente lavadas com PBS 1x. Alimente as células diariamente e divida-as a cada 2 a 3 dias, dependendo da densidade.
      NOTA: Morfologicamente, as colônias de células-tronco embrionárias (ES) devem ser pequenas, arredondadas e bem delimitadas entre si.
2. Passe as mESCs para o formato de placa de 12 poços (100.000 células/poço) um dia antes da infecção.
   1. Conte as células com um hemocitômetro. Para células cultivadas em formato de 10 cm, aspire o meio antigo, adicione 5 mL de PBS 1x, aspire o PBS e adicione 1 mL de tripsina a 0,25%. Incube as células na tripsina por 8 min a 37 °C, agitando e batendo levemente na placa na metade do tempo de incubação. O objetivo desta etapa é obter uma suspensão de células individuais.
3. 48 h após a troca do meio das células 293T de rim embrionário humano (HEK) da placa de 15 cm, remova e transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 50 mL.
4. Centrifugue o sobrenadante a 300 x g por 5 min para formar um pellet de detritos celulares.
5. Filtre o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 µm.
   NOTA: Certifique-se de usar membranas de acetato de celulose sem surfactante (SFCA), pois alguns outros materiais podem reter o vírus e reduzir significativamente os rendimentos.
6. Concentre o vírus por ultracentrifugação, utilizando uma centrífuga com rotor SW32, e gire a 20.000 rpm (~72.000 x g) por 2,5 h a 4 °C.
7. Enquanto o vírus é concentrado por ultracentrifugação, trate as mESCs CiA na placa de 12 poços com meio ES fresco contendo 5 µg/mL de polibreno.
8. Quando a concentração do vírus for concluída, aspire cuidadosamente o sobrenadante e suspenda o pellet viral em 100 µL de PBS 1x (evite bolhas em excesso).
9. Adicione o vírus e o PBS 1x a um tubo microfuge de 1,5 mL. Vortexa/agite o tubo a 300 x g (ou na configuração mais baixa) para suspender completamente o vírus. Centrifugue o tubo em uma centrífuga de bancada miniatura por 5 a 10 s para remover bolhas.
10. Adicione 30 µL do vírus a cada poço de uma placa de 12 poços. Agite suavemente a placa e, em seguida, centrifugue-a a 1.000 x g por 20 min.
    NOTA: A quantidade de vírus adicionada pode ser variada conforme o título viral, que é inversamente proporcional ao tamanho do construto de entrega.
    1. Alternativamente, congele rapidamente o vírus com nitrogênio líquido e armazene-o a -80 °C. No entanto, congelar o vírus reduzirá o título viral.
11. Coloque a placa de 12 poços de volta na incubadora a 37 °C e troque o meio na manhã seguinte (~16 h depois) por meio ES fresco.
12. Após 48 h de infecção, selecione as células que integraram o plasmídeo viral adicionando o antibiótico apropriado (por exemplo, 1,5 µg/mL de puromicina, 10 µg/mL de blasticidina, etc.). Troque o meio diariamente e lave as células com PBS 1x se a maioria delas estiver flutuando/morta. Mantenha o meio de seleção nas células por 72 a 96 h em incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (para cultura de tecidos)	Corning	25-060-Cl
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	Lotes individuais testados quanto à qualidade
Tubos para centrífuga de vírus	Beckman Coulter	344058
Membrana de filtro para vírus	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
Tripsina 0,25 %	Gibco	25200-056	com EDTA
Tripsina 0,05 %	Gibco	25400-054	com EDTA
Puromicina	InvivoGen	ant-pr
Ultracentrífuga	Optima	XPN-80
Rotor de centrífuga SW-32	Beckman Coulter	14U4354
Cubas para rotor de centrífuga SW-32 Ti	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 Células renais embrionárias humanas	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	Doação gentil de G. Crabtree
Células Cos produtoras de Lif-1C-alpha	Doação gentil de J. Wysocka