Identificação de Células Infectadas por Vírus Vaccinia Recombinante Utilizando Seleção Metabólica e Fluorescente

Resumo

Fonte: Marzook, N. B., et al., Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus Vaccinia Marcadas com Fluorescência. J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo demonstra a geração de vírus vaccinia recombinantes utilizando recombinação homóloga mediada por plasmídeo em células epiteliais infectadas. Marcadores fluorescentes e metabólicos permitem a seleção e identificação de vírus que expressam proteínas marcadas.

Protocolo

Geração de Vírus Recombinante

1. Conforme a Figura 1, infecte uma monocamada de células BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (uma linhagem de células epiteliais de rim de macaco derivada de células CV-1)] com o vírus vaccinia em meio sem soro, com uma Multiplicidade de Infecção (MOI) > 1.
2. 1 hr após a infecção, recupere as células com meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e transfete com uma mistura de plasmídeo do vetor de recombinação e reagente de transfeção na proporção de 3:1 em meio sem soro.
3. Após 24 hr, raspe e recupere as células em DMEM sem soro bovino fetal (FBS) e realize três ciclos de congelamento-descongelamento para romper as células e liberar partículas virais.
4. Realize um ensaio de placa com uma cobertura líquida de DMEM com 10% de FBS e reagentes de seleção GPT (guanina fosforribosiltransferase (de E. coli), ácido micofenólico (25 µg/ml) e xantina (250 µg/ml) da seguinte forma:
   1. Semente uma placa de 6 poços com uma monocamada de células BS-C-1.
   2. Infecte monocamadas de células 100% confluentes com diluições seriadas das células submetidas a congelamento-descongelamento contendo partículas virais, para garantir separação adequada de placas individuais.
   3. Cubra com DMEM líquido contendo 10% de FBS e os reagentes de seleção GPT — ácido micofenólico e xantina nas concentrações finais de 25 µg/ml e 250 µg/ml, respectivamente.
5. Após uma incubação de 24 hr, remova a cobertura líquida e use um microscópio de fluorescência para identificar placas que exibam fluorescência vermelha difusa correspondente à incorporação de mCherry do vetor TDS (seleção dominante transitória) no vírus. Dependendo do gene alvo e da marcação fluorescente escolhida, fluorescência localizada do gene marcado também pode ser observada na mesma placa vermelha.
6. Escolha múltiplas placas para cada vírus recombinante por meio de raspagem localizada com a ponteira de uma pipeta e 100 µl de DMEM contendo 5% de FBS para transferir as células para um tubo Eppendorf, seguido por três ciclos de congelamento-descongelamento das células raspadas para liberar os vírus recombinantes.
7. Adicione o DMEM contendo o vírus submetido a congelamento-descongelamento a uma monocamada de células em uma placa de 12 poços para amplificar os vírus recombinantes com os reagentes de seleção GPT no meio de crescimento. Raspe as amplificações bem-sucedidas 24 hr após a infecção.
8. Realize um ensaio de placa das placas amplificadas com sucesso que exibem fluorescência vermelha, desta vez com uma cobertura de agarose e seleção GPT, da seguinte forma:
   1. Semente uma placa de 6 poços com uma monocamada de células BS-C-1.
   2. Realize uma diluição seriada dos vírus recombinantes e infecte os poços com diluições crescentes de vírus em DMEM sem FBS.
   3. 1 hr após a infecção, remova o meio líquido e cubra cada poço com 0,5% de agarose em meio essencial mínimo (MEM) contendo 2,5% de FBS, 292 µg/ml de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina, juntamente com os reagentes de seleção GPT.
9. 2-3 dias após a infecção, selecione placas que exibam fluorescência vermelha e também a cor da marcação fluorescente escolhida para amplificar novamente, desta vez sem seleção GPT.
10. Realize o próximo ensaio de placa com cobertura de agarose sem seleção.
11. Escolha placas que perderam a fluorescência vermelha difusa, mas mantiveram a fluorescência localizada correspondente à marcação escolhida.
12. Continue o processo de purificação por placas sem seleção para obter um estoque puro de vírus recombinantes que perderam os genes de seleção mCherry e gpt, mas mantiveram a fluorescência localizada correspondente à marcação escolhida. Verifique a pureza dos estoques por ensaio de placa; todas as placas devem apresentar um fenótipo de placa semelhante.

Resultados

Figura 1. Esquema do procedimento experimental para criar um vírus vaccinia recombinante. São representados os eventos que ocorrem nos níveis genético e celular, juntamente com imagens representativas de placas que ilustram as etapas após a criação de um vírus vaccinia fluorescente marcado com A3-GFP. (A) Células infectadas com o vírus vaccinia são transfectadas com o vetor de recombinação TDS. (B) Nesta figura, apenas o resultado da recombinação do lado esquerdo é representado, e o exemplo utiliza GFP como a marca fluorescente escolhida. A recombinação do lado direito resultaria na incorporação completa do plasmídeo TDS ao genoma de maneira semelhante, exceto pelo fato de que a marca seria fundida a todo o gene-alvo na etapa intermediária, ou seja, etapa C. Um ensaio de placa é realizado em uma monocamada celular com a mistura de recombinação e submetido à seleção GPT. (C) Placas que exibem fluorescência vermelha e verde, correspondentes à expressão de mCherry e GFP, respectivamente, são selecionadas e amplificadas. Uma vez removida a seleção, haverá perda da fluorescência vermelha, correspondente à perda dos genes gpt e mCherry (D), e placas que exibem exclusivamente fluorescência verde são selecionadas e amplificadas (E).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido micofenólico	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Dissolver em NaOH 0,1 N
Xantina	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Dissolver em NaOH 0,1 N
Reagente de transfeção FuGENE HD	Promega	E2311
Microscópio de fluorescência equipado com filtros Chroma 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)