Transdução Adenoviral Combinada e Knockdown Mediado por siRNA em Células Cancerígenas

Resumo

Fonte: Fuchs, M. et al. Adenofecção: Um Método para Estudar o Papel das Chaperonas Moleculares na Morfodinâmica Celular por meio de Experimentos de Esgotamento e Resgate. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a entrega mediada por adenovírus de um transgene fluorescente combinada com transfeção de siRNA-fosfato de cálcio em células de câncer cervical. O adenovírus expressa uma proteína de substituição fluorescente, enquanto o siRNA induz a degradação direcionada do mRNA por meio da ligação ao RISC. Essa co-transfeção sequencial permite o silenciamento simultâneo da proteína endógena e o resgate funcional pela transgene, possibilitando a visualização e confirmação da substituição proteica por meio de imagem de fluorescência.

Protocolo

1. Transdução por adenovírus e silenciamento da proteína endógena por transfeção de RNA interferente pequeno (siRNA) em células HeLa-RFP-H2B utilizando precipitados de fosfato de cálcio (CaPi)

NOTA: Um adenovírus controle que carrega um gene não relacionado (ou seja, LacZ) ou nenhum gene é usado para atingir uma multiplicidade de infecção mínima (MOI) em todas as adenofecções (10-20 unidades formadoras de placas (PFU)/célula), utilizando a menor quantidade possível de adenovírus recombinante que carrega o gene de interesse.

NOTA: Este procedimento demonstrou ajudar a normalizar a expressão por célula em uma grande população celular.

1. Um dia após o plaqueamento das células, conte o número de células a partir da lâmina adicional plaqueada. Aspire o meio e lave uma vez com 1 mL de Tripsina 0,05%/ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). Adicione novamente 1 mL de Tripsina 0,05%/EDTA e incube em 37 °C, 5% CO₂₂ até que todas as células se desprendam. Dissocie bem as células utilizando uma pipeta de 1 mL e conte o número de células por mL usando um hemocitômetro.
2. Determine a quantidade de vírus necessária para transduzir as células com uma MOI de 2 PFU da proteína de interesse (POI) por célula e 18 PFU por célula de um vetor vazio (por exemplo, LacZ), totalizando 20 PFU por célula. Ao mesmo tempo, transduza 4 PFU de cada baculovírus que codifica a actina marcada com proteína verde fluorescente (GFP) e a proteína vermelha fluorescente (RFP) marcada α-tubulina. Transduza as células utilizando o seguinte protocolo de adenofecção.
3. Prepare em uma câmara de fluxo laminar um tubo plástico de 1,5 mL para cada condição e adicione 400 μL de meio mínimo essencial alfa aquecido (αMEM).
4. Descongele uma alíquota dos vírus lentamente no gelo e, se necessário, dilua o estoque viral para pipetar um volume maior que 1 μL para minimizar erros de pipetagem.
5. Adicione a quantidade calculada de vírus por condição a cada tubo plástico de 1,5 mL contendo 400 μL αMEM e misture suavemente por pipetagem. Coloque imediatamente o estoque do vírus de volta a -80 °C para manter sua atividade.
6. Aspire o meio das células e pipete suavemente a mistura de vírus gota a gota. Incube as células em 37 °C, 5% CO₂₂ e agite as placas cuidadosamente sob a capela de segurança a cada 15 min durante 1 h para garantir que as células fiquem bem cobertas pelo vírus. O uso de uma pequena quantidade de meio facilita o contato do vírus com as células.
7. Após a incubação, pipete suavemente 1,6 mL αMEM a cada placa para obter um volume total de 2 mL, inicie a sincronização celular pela adição de timidina 2 mM e incube as células por mais 2 h a 37 °C, 5% CO₂₂.
8. Enquanto isso, prepare a mistura de transfeção de siRNA seguindo o método de transfeção com fosfato de cálcio (CaPi) (consulte Figura 1). Se nenhum siRNA for necessário, substitua a quantidade de siRNA por água estéril para realizar uma transfeção vazia.
9. Calcular 200 μL mistura para cada condição, resultando em 400 μL por duplicata. O exemplo a seguir é fornecido para uma concentração final de siRNA de 50 nM e deve ser adaptado para cada proteína de interesse. Em um tubo plástico de 1,5 mL, pipete 50 μL 1 M CaCl₂₂ e 11 μL 20 μM siRNA em 139 μL H estéril₂O e misture por vortexagem. Após uma centrifugação rápida, adicione cuidadosamente 200 μL 2× Salina tamponada com HEPES (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico (HEPES), 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,01–7,05) gota a gota.
   OBSERVAÇÃO: Quanto menores as gotas, menores serão os precipitados, resultando em maior eficiência de transfeção. Misture suavemente três vezes por injeção de ar utilizando uma 200 μL pipeta
10. Incube a mistura por 30 min à temperatura ambiente (TA). Adicione lentamente 200 μL da mistura de transfeção para cada placa e agite transversalmente. Transfira as placas para 37 °C, 5% CO₂₂ por 16 h.
11. No dia seguinte, lave as células duas vezes com 2 mL de HEPES morno (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) e adicione 2 mL αMEM. Não prossiga com mais de quatro placas celulares ao mesmo tempo, pois variações de temperatura afetam a duração do ciclo celular.
12. Visualize a eficiência da infecção em um microscópio fluorescente invertido com uma ampliação de 20-40x (ar) e adquira três imagens representativas por condição, em ambos os canais fluorescente e de transmissão, para documentação. Sete horas depois, adicione timidina 2 mM e incube por mais 16 horas a 37 °C, 5% CO₂₂.
13. No dia seguinte, 48 horas após a transfeção com siRNA e infecção viral, lave as células duas vezes com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) morna e incube por 7 horas em 2 mL αMEM sem Fenol Vermelho para imagem de células vivas ou com Fenol Vermelho para extração de proteínas.
14. Colete as células para cada condição 48 horas após a transfeção para o preparo de extratos proteicos e análise por Western blot, a fim de determinar a eficiência do silenciamento e a expressão da proteína endógena.
    OBSERVAÇÃO: Utilize anticorpos contra a proteína de interesse, bem como anticorpos apropriados que sirvam como controles de carga. A eficiência do silenciamento deve ser determinada por meio da carga de quantidades decrescentes de lisados de células-controle (transfectadas com siRNA controle) para gerar uma curva de titulação (ou seja, 1, ½, ¼, ⅛).

Resultados

Figura 1. Planejamento de um protocolo típico de adenofecção. São apresentadas as etapas sucessivas de um experimento típico para o protocolo utilizando precipitados de CaPi (sublinhados em cinza) ou o protocolo utilizando um reagente de transfeção com lipídio catiônico (destacado em amarelo), incluindo o plaqueamento celular, transdução por adenovírus e baculovírus, transfeção de duplex de siRNA e sincronização celular com bloqueio duplo de timidina. As linhas do tempo em horas para ambos os protocolos são mostradas no lado direito da figura.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
EDTA	Sigma	E5134
Soro bovino fetal (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectina	Sigma	F1141
Placas com fundo de vidro, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Doação gentil da Dra. Sabine Elowe, Québec, Canadá
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamina	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
Meio Essencial Mínimo (MEM) Alfa	Wisent	310-101-CL
Meio Essencial Mínimo (MEM) Alfa sem Desoxirribonucleosídeos/Ribonucleosídeos	Thermo Fisher	12000-022
Meio Essencial Mínimo (MEM) Alfa sem Fenol Vermelho	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
Projeto personalizado de adenovírus	Welgen	Projeto personalizado
Cloreto de Cálcio	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actina-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulina-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Duplexes de siRNA	Dharmacon	Projeto personalizado
Timidina	Sigma	T9250
Tripsina 2,5%	Thermo Fisher	15090-046