Marcação de Resíduos de Cisteína Acessíveis à Superfície em Partículas Semelhantes a Vírus Engenheiradas

Resumo

Fonte: Natilla, A., e Hammond, R. W. Análise da Acessibilidade ao Solvente de Resíduos de Cisteína em Partículas Semelhantes a Vírus do Maize rayado fino produzidas em plantas de Nicotiana benthamiana e Cruzamento de Peptídeos com as Partículas. J. Vis. Exp. (2013)

Este vídeo demonstra a marcação fluorescente específica em sítios de partículas semelhantes a vírus (VLPs) mutantes produzidas em Nicotiana benthamiana utilizando um corante reativo a tióis, seguida por purificação e eletroforese em gel para confirmar a modificação da superfície.

Protocolo

1. Inoculação Viral e Purificação de Partículas Semelhantes a Vírus (VLPs) de Plantas de Nicotiana benthamiana

1. Produza transcritos de T7-RNA com capuz a partir de plasmídeos vetoriais baseados no Potato virus X (PVX) carregando os genes do tipo selvagem (wt) do Maize rayado fino virus (MRFV) e da proteína do capsídeo mutante de Cisteína (CP), utilizando o Kit T7-mMessage mMachine da Ambion.
2. Para cada reação de transcrito de T7, inocule duas folhas completamente expandidas de N. benthamiana com 10 μL da reação e incube as plantas por 10 dias em estufa, com 60% de umidade, durante 16 h com luz (25.000-30.000 lux) a 25 °C e 8 h de escuro a 20 °C.
3. Colete as folhas infectadas por vírus de N. benthamiana 10 dias após a inoculação (dpi), pese o tecido vegetal (50 gramas) e coloque sobre gelo.
4. Homogeneíze o material vegetal em um liquidificador na presença de 100 mL de uma solução gelada de tampão de Na-Citrato 0,5 M, pH 5,5 (utilize 2 mL de tampão por grama de tecido vegetal).
5. Filtre o homogeneizado através de 3 camadas de gaze e clarifique por centrifugação a 27.000 × g durante 30 min. Transfira o sobrenadante para um cilindro graduado gelado, meça o volume e, em seguida, transfira para um béquer estéril gelado. Descarte o pellet.
6. Processe o sobrenadante adicionando 10% de polietilenoglicol 8.000 (PEG 8.000), agite por 15 min a 4 °C e incube por mais 45 min a 4 °C para precipitar a matriz de partículas semelhantes a vírus (VLPs)-PEG.
7. Centrifugue a amostra a 27.000 × g por 20 min a 4 °C e remova o sobrenadante.
8. Processe o pellet adicionando 8 mL de tampão de Na-Citrato 0,05 M, pH 5,5, contendo 2% de Triton X-100. Agite bem os tubos de centrífuga para liberar o pellet. Transfira o pellet e o tampão para um béquer estéril gelado. Enxágue imediatamente os tubos com 2 mL do mesmo tampão e adicione ao béquer. Agite a suspensão a 4 °C até que os pellets se dissolvam (geralmente 1 h).
9. Clarifique por centrifugação por 5 min a 27.000 × g, descarte o pellet e processe o sobrenadante por centrifugação a 140.000 × g por 2 h a 4 °C.
10. Resuspenda o pellet em 1 mL de tampão de Na-Citrato 0,05 M, pH 5,5 e coloque a suspensão sobre uma gradiente de sacarose de 10-40% preparada em tampão de Na-Citrato 0,05 M, pH 5,5.
11. Centrifugue o gradiente por 3 h a 140.000 × g a 4 °C.
12. Ilumine a parte superior do tubo de centrífuga e colete a banda superior dispersora de luz a 4 cm do topo do tubo, dilua com tampão de Na-Citrato 0,05 M, pH 5,5, e centrifugue por 3 h a 140.000 × g a 4 °C.
13. Resuspenda o pellet em 0,5 mL de água estéril e armazene a 4 °C por até seis meses.
14. Quantifique a concentração das VLPs realizando um ensaio de proteína de Bradford. O rendimento das VLPs está entre 1 e 3 μg/g de tecido vegetal.

2. Reações de marcação com fluoresceína-5-maleimida de VLPs

1. Prepare uma solução de 1 mM de fluoresceína-5-maleimida (427,37 g/mol) em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0; 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). Misture utilizando um vórtex e verifique a dissolução completa. Proteja o tubo da luz usando folha de alumínio.
2. Adicione fluoresceína-5-maleimida aos VLPs produzidos na etapa 1 e misture. Utilize um excesso molar 25 vezes maior de fluoresceína-5-maleimida em relação à quantidade molar de sulfidrilas. Geralmente, o uso de 30 μL de VLPs na concentração de 1 μg/μL e 60 μL da solução de fluoresceína-5-maleimida produz resultados aceitáveis.
3. Incube a reação por 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
4. Termine a reação adicionando ditiotreitol (DTT) até uma concentração final de 50 mM.
5. Remova a fluoresceína não reagida utilizando uma coluna de centrifugação para dessalinização (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) e centrifugação por 2 min a 1.500 × g à temperatura ambiente.
6. Para análise por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), adicione 10 μL de tampão amostra Laemmli 2 × SDS-PAGE a 10 μL de cada reação. Armazene a proteína marcada protegida da luz a 4 °C por até um mês ou em alíquotas de uso único a -20 °C por até 3 meses.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos ultraclaros de parede fina	Beckman	344059
Kit mMESSAGE mMACHINE T7	Life Tecnologies	AM1344M
Fluoresceína-5-maleimida	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130 está fora de uso; substituir por F150
Tampão de Laemmli	Bio-Rad	1610737
Tampão de corrida Tris-Glicina SDS (Dodecilsulfato de sódio)	Invitrogen	LC2675
Tampão de transferência Tris-Glicina	Invitrogen	LC3675
Sanduíche de papel filtro e membrana de nitrocelulose	Invitrogen	LC2001
Maleimida-Poliethylene glicol (PEG) 2-Biotina EZ-Link, formato sem pesagem	Thermo Scientific	21901