Produção de Partículas Semelhantes a Vírus em E. coli Modificada

Resumo

Fonte: Chen, Z., et al. Produção de Partículas Semelhantes a Vírus PEGiladas Fluorescentes Induzidas por Conjugação por Química de Dibromomaleimida-dissulfeto. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o método para a expressão controlada da proteína do capsídeo do bacteriófago Qβ em E. coli modificada geneticamente. As proteínas resultantes se autoagrupam em partículas semelhantes a vírus, que são colhidas para bioconjugação subsequente.

Protocolo

Expressão de Qβ

1. Limpe a área da bancada com solução de hipoclorito/etanol na proporção 1:1.
2. Prepare dois cultivos iniciadores de 3 mL em ambiente asséptico, adicionando colônias isoladas de E. coli BL21(DE3) a 3 mL de meio Super Optimal Broth (SOB) em ambiente asséptico.
3. Incube em agitador a 250 rpm, em sala a 37 °C e 0% de umidade relativa (rH), durante a noite.
4. Inocule o cultivo inicial no meio SOB:
   1. Retire ambos os cultivos iniciadores de 3 mL do agitador e, em ambiente asséptico, transfira cada um para um dos dois frascos Erlenmeyer baforado de 2 L contendo 1 L de meio SOB fresco.
   2. Coloque os meios inoculados em agitador a 250 rpm, em sala a 37 °C e 0% de rH.
5. Cultive as bactérias em agitador a 250 rpm, em sala a 37 °C e 0% de rH, até que a DO₆₀₀ alcance 0,9–1,0.
6. Adicione 1 mL de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) 1 M utilizando uma pipeta P1000 para induzir a expressão proteica.
7. Mantenha o meio em agitador a 250 rpm, em sala a 37 °C e 0% de rH, durante a noite.
8. No dia seguinte, retire o meio do agitador e centrifugue utilizando frascos de 1000 mL a 20.621 × g por 1 h a 4 °C para colher as células.
9. Descarte o sobrenadante e colete o pellet celular.
   1. Despeje o sobrenadante em um frasco contendo cerca de 5 mL de hipoclorito para inativar as bactérias. Este é um resíduo.
   2. Utilize uma espátula para raspar o pellet celular do fundo do frasco de centrífuga e transfira o pellet para um tubo cônico de 50 mL.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo LB (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptona, Pó	Research Products International	T60060-1000.0
Extrato de Levedura, Pó	Research Products International	Y20020-1000.0
Sulfato de magnésio anidro	P212121	CI-06808-1KG
Cloreto de Sódio (Cristalino/Certificado ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Cloreto de Potássio	Fisher Scientific	BP366-500
Sistema de Purificação de Água Elga PURELAB Flex 3	Fisher Scientific	4474524
Fosfato Monobásico de Potássio	Fisher Scientific	BP362-1
Fosfato Dibásico Anidro de Potássio	Fisher Scientific	P288-500
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Frascos Centrífugos Nalgene com Tampas, Copolímero de Polipropileno	Thermo Scientific	3141-0250
Agitador Orbital VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetador P1000	Gilson	F123602
Tubo Cônico Centrífugo Falcon de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22