Funcionalização Fluorescente de Partículas Semelhantes a Vírus via Re-ponteamento de Dissulfetos

Resumo

Fonte: Chen, Z., et al. Produção de Partículas Semelhantes a Vírus PEGiladas Fluorescentes Induzidas por Conjugação por Química de Dibromomaleimida-dissulfeto. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a funcionalização fluorescente de partículas semelhantes a vírus por meio da reconstituição de dissulfetos reduzidos com um ligador de polietilenoglicol (PEG), produzindo conjugados estáveis e rastreáveis adequados para imagem celular e entrega direcionada em aplicações biomédicas.

Protocolo

1. Conjugação de Compostos Dibromomaleimida (DB) em Bacteriófago Qβ

1. Reduzir dissulfetos em Qβ.
   1. Dissolver 0,0020 g de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) em 1 mL de água ultrapura para preparar uma solução estoque 100x.
      NOTA: Preparar o TCEP fresco antes da redução.
   2. Adicionar 200 µL de Qβ (5 mg/mL) em um tubo de microcentrífuga.
   3. Em seguida, adicionar 20 µL da solução estoque de TCEP 100x.
   4. Incubar à temperatura ambiente por 1 h.
2. Recombinar o dissulfeto reduzido utilizando polietilenoglicol dibromomaleimida (DB-PEG).
   1. Dissolver 0,0017 g de dibromomaleimida-polietilenoglicol (DB-PEG) em 100 µL de DMF.
   2. Adicionar 680 µL de solução de fosfato de sódio 10 mM (pH 5).
   3. Adicionar Qβ reduzido à solução de DB-PEG e observar o processo de mistura sob uma lâmpada UV (ultravioleta) de 365 nm. A fluorescência amarelo-brilhante pode ser visualizada imediatamente com uma lâmpada UV portátil de 365 nm após a mistura.
   4. Deixar a reação prosseguir durante a noite à temperatura ambiente (RT) em um rotisserie.
3. Purificar a mistura de reação por filtro centrífugo (corte de peso molecular (MWCO) = 10 kDa) três vezes usando PBS 1x (solução salina tamponada com fosfato) a 3.283 x g por 20 min a 4 °C.
4. Monitorar a conjugação por SDS-PAGE não redutor (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio) e eletroforese em gel de agarose nativa.
   NOTA: As VLPs (partículas semelhantes a vírus) migram como partículas intactas em gel de agarose nativo e são separadas com base em sua carga, tamanho e forma.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2 3-Dibromomaleimida 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polietileno glicol	Alfa Aesar	41561-22
Fosfato de sódio	Fisher Scientific	AC424375000
Acrilamida/bis-acrilamida	P212121	RP-A11310-500.0
Dodecilsulfato de sódio	Sigma Aldrich	L3771-100G
Persulfato de amônio	Fisher Scientific	BP179-100
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-4	Millipore Sigma	UFC801024
Tubo cônico centrífugo Falcon de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
Tubo de microcentrífuga: 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Agitador orbital VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P10	Gilson	F144802
Balança laboratorial clássica de alta precisão Intel Weighing PM-100	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100