Preparação Segura de Espécimes Virais para Microscopia Eletrônica de Transmissão

Resumo

Fonte: Blancett, C. D., et al. Utilização de Cápsulas para Coloração Negativa de Amostras Virais dentro de Biocontenção. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra o preparo seguro de espécimes virais para microscopia eletrônica de transmissão. As partículas virais são fixadas com glutaraldeído, coradas com um agente denso aos elétrons e submetidas à fixação por vapor com tetróxido de ósmio para estabilizar as estruturas e garantir a inativação completa, assegurando o manuseio seguro de amostras virais enquanto melhora o contraste para imagens de TEM de alta qualidade.

Protocolo

1. O Método da Cápsula para Coloração Negativa em Biocontenção utilizando Glutaraldeído Aquoso e Inativação por Vapor de Tetróxido de Osmio a 1%

1. Dentro da cabine de segurança biológica (BSC) de contenção biológica, aspire 40 µL de suspensão viral para dentro da cápsula acoplada a uma pipeta.
   NOTA: A pipeta permanece acoplada à cápsula até que o processo seja concluído.
2. Coloque a pipeta de lado por 10 min com as grades orientadas horizontalmente. Isso visa promover uma distribuição uniforme das partículas virais sobre as grades revestidas.
3. Inative o vírus dentro da cápsula, dentro da BSC de contenção biológica.
   1. Levante a pipeta e pressione o êmbolo para dispensar a solução viral em um recipiente de resíduos.
   2. Aspire 40 µL de fixador com 2% de glutaraldeído para dentro das cápsulas. Atenção: O glutaraldeído é um produto químico perigoso e exige proteção adequada. Pode ser usado por períodos curtos em uma BSC comum, mas o manuseio prolongado com o reagente aberto exige trabalho em uma BSC com dutos ou capela de exaustão química.
   3. Coloque a pipeta de lado por 20 min. Isso garante que as amostras sejam bem fixadas.
   4. Expulse o fixador e aspire 40 µL de água DI (desionizada) para dentro das cápsulas para lavar o fixador. Repita este passo de lavagem por um total de 3 ciclos de enxágue.
4. Aspire 40 µL de acetato de uranila a 1% (UA) ou ácido fosfotungstático de potássio a 1% (PTA) para dentro das cápsulas e deixe repousar por 30 s.
   NOTA: O tempo de coloração pode variar de 10 s a 1 min, dependendo da amostra viral.
   ATENÇÃO: O UA é um emissor alfa e uma toxina cumulativa. Manipule com proteção adequada.
5. Remova a cápsula da pipeta e seque as grades tocando um pedaço de papel filtro na borda das grades, enquanto as grades permanecem dentro da cápsula.
6. Procedimento de inativação por vapor de tetróxido de ósmio.
   1. Coloque a cápsula, com a tampa aberta, em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo papel filtro embebido em uma solução de tetróxido de ósmio a 1%. Atenção: O tetróxido de ósmio é extremamente tóxico e possui baixa pressão de vapor. Deve ser usado em uma BSC com dutos ou capela de exaustão química. Manipule com proteção adequada. Exiba informações de advertência na área de trabalho.
   2. Feche hermeticamente o tubo de centrífuga de 50 mL por 1 h para permitir a permeação completa do vapor de tetróxido de ósmio. Em seguida, descontamine e transfira o tubo para fora da área de contenção biológica até a instalação de ME (microscopia eletrônica) de nível BSL-2.
7. Remova as grades de ME da cápsula.
   1. Na instalação de ME de nível BSL-2, remova a cápsula do tubo de centrífuga e coloque-a em uma pipeta.
   2. Aspire 40 µL de água DI para dentro da cápsula e dispense a água em um recipiente de resíduos três vezes.
   3. Remova a cápsula da pipeta e seque as grades usando papel filtro para tocar a borda das grades.
   4. Após a secagem ao ar, armazene as grades para posterior imagem por MET (microscopia eletrônica de transmissão).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grade de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) recobertas com Formvar/carbono	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
Cápsulas mPrep/g	EMS	85010-01	caixa
Conectores mPrep/f	EMS	85010-11	padrão 16/Pk
Glutaraldeído	EMS	16320	solução a 50%, grau microscopia eletrônica
Tetraóxido de ósmio	EMS	19190	solução aquosa a 4%
Acetato de uranila	EMS	22400	pó
Ácido fosfotungstico de potássio	EMS	19500	pó
Papel filtro	Whatman	1450-090	tamanho 50
Microscópio eletrônico de transmissão	JEOL	JEM-1011	TEM