Detecção de Intermediários de Replicação de dsRNA do Vírus Zika Utilizando Imunocitoquímica

Resumo

Fonte: Contreras, D., et al.Sistema de cultura celular infecciosa pelo vírus Zika e o efeito profilático in vitro de interferons. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo demonstra a detecção de intermediários de dsRNA do vírus Zika em células epiteliais infectadas utilizando imunocitoquímica. As células infectadas são fixadas e então bloqueadas com uma solução de bloqueio. Os anticorpos primário e secundário são adicionados. Os núcleos são corados com um corante fluorescente. O dsRNA viral marcado é então visualizado em um microscópio de fluorescência.

Protocolo

1. Ensaio de replicação do genoma viral do Zika

1. Plante células Vero ingênuas a 1 x 10⁵ células por poço em volumes de 2 ml utilizando uma placa de 12 poços. No dia seguinte, prepare inóculos virais (Multiplicidade de Infecção (MOI) de 0,01 e 0,1; 400 µl/poço) de título baixo e alto utilizando meio sem soro em triplicata. Para infecção controle, utilize apenas meio sem soro (400 µl/poço).
2. Incube a placa inoculada a 37 °C com 5% de CO₂ por 4-6 horas. Espalhe o inóculo inclinando suavemente a placa lateralmente a cada uma hora.
3. No final da incubação, substitua o inóculo por meio suplementado com soro (2 ml por poço).
4. Nos pontos temporais de 48 e 96 horas, colete as amostras para imunocitoquímica (ICC).
5. Realize a ICC utilizando as células fixadas com metanol.
   1. Lave as células fixadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) e bloqueie com tampão de bloqueio para ICC (3% de soro de cabra, 3% de albumina sérica bovina (BSA), 0,1% de Triton-X 100 em PBS).
   2. Utilize o anticorpo monoclonal de camundongo anti-RNA-ds J2 (1 µg/ml) em uma diluição de 1:100 no tampão de bloqueio e incube durante a noite a 4 °C.
   3. Lave as células com PBS 1x e adicione um anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo-594 (1 µg/ml) em uma diluição de 1:1.000 no tampão de bloqueio e incube por uma hora à temperatura ambiente.
   4. Lave as células com PBS 1x e contra-estaine os núcleos utilizando corante Hoechst e observe as células em um microscópio de fluorescência com aumento de 100X (Figura 1).

Resultados

Figura 1: Ensaios para avaliar a replicação do vírus Zika (ZIKV). (A) O gráfico mostra o conteúdo genômico do vírus Zika medido por reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR). Os iniciadores pan-genotípicos (ZIKV GEN) e os do linhagem PRVABC59 (ZIKV UNI) apresentaram sensibilidade e especificidade iguais. Conforme esperado, os iniciadores do vírus da hepatite C (HCV) não amplificaram nenhum produto. (B) O gráfico apresenta a cinética de crescimento do vírus Zika nos pontos de tempo indicados em células infectadas com baixo e alto título, comparado ao controle mock não infectado. São apresentados os valores médios e os desvios-padrão. (C) Ensaio de imunocitoquímica para investigar a replicação viral. Células infectadas pelo vírus Zika foram especificamente coradas com anticorpos anti-RNA dupla fita (dsRNA). Aos 48 hpi, as células infectadas estão em poucos aglomerados, enquanto aos 96 hpi, a maioria das células está infectada. A coloração com Hoechst foi utilizada para visualização dos núcleos (Barra de escala = 50 µm). BF: imagem de campo claro.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-RNA de cadeia dupla J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
Linhagem celular Vero	ATCC	CCL-81
Estirpe viral Zika PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
Microscópio de imunofluorescência Nikon Eclipse Ti com C-HGFI Nikon Intensilight	Nikon	Visit Nikon for Request