Concentração e Purificação de Partículas Virais

Resumo

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Planejamento, Embalagem e Entrega de Retro e Lentivírus CRISPR de Alto Título por Injeção Estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra o processo passo a passo para concentrar e purificar partículas lentivirais a partir de uma suspensão mista contendo detritos de células hospedeiras. O procedimento utiliza centrifugação, filtração e precipitação com PEG-sal para isolar as partículas virais, removendo impurezas solúveis. O produto final é ressuspenso em um tampão e armazenado em temperaturas ultra-baixas para preservar a infectividade viral e a integridade estrutural.

Protocolo

1. Concentração e Purificação do Vírus

1. Prepare uma solução 5x de polietilenoglicol 6000 adicionando 40% de polietilenoglicol 6000 e 1,5 M de NaCl à água ddH₂O. Autoclave a solução no ciclo para líquidos por 45 min a 121 °C. Misture lentamente a solução durante o resfriamento.
   NOTA: A solução começará turva e depois ficará clara ao esfriar.
2. Centrifugue o tubo cônico de 50 ml contendo ambas as coletas de sobrenadante viral a 2.000 x g por 10 min para formar o pellet do material insolúvel. Purifique o meio viral filtrando através de um filtro de seringa com baixa ligação a proteínas de 0,45 µm (PES ou PVDF).
3. Adicione a solução 5x de polietilenoglicol 6000 ao meio (a concentração final deve ser de 8% de polietilenoglicol 6000 e 0,3 M de NaCl). Misture invertendo o tubo várias vezes (não vortex). Incube a solução contendo o polietilenoglicol com o vírus a 4 °C por 12 horas ou mais, remexendo ocasionalmente.
4. (Dia 9) Centrifugue a solução contendo o polietilenoglicol com o vírus a 2.500 x g por 45 min. Remova e descarte o sobrenadante e centrifugue novamente por 2 min. Remova e descarte novamente o sobrenadante.
5. Resuspenda o pellet adicionando 320 µl de solução salina tamponada com fosfato estéril (os 320 µl correspondem a 1/100 do volume original do meio coletado contendo o vírus) e incube durante a noite a 4 °C. Opcionalmente, ressuspenda o pellet à temperatura ambiente em um agitador por 30 min.
6. Após ressuspendido o pellet, alíquote o vírus (5-10 µl por tubo de 0,5 ml) e congele os alíquotas a -80 °C (os ciclos de congelamento-descongelamento ou armazenamento a 4 °C reduzirão drasticamente o título).
7. Determine o título dos vírus utilizando protocolos padrão, ou seja, realize uma série de diluições em uma placa de 6 poços com células HEK293T e conte manualmente as colônias fluorescentes 48 horas depois.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lista de Reagentes de Transfecção
Tubos de poliestireno de 5 ml	Fisher Scientific	352054
polietileno glicol 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	National Diagnostics	CL-253
Tubos microcentrífugos de 0,5 ml	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A