Avaliação de um Sistema de Overlay Líquido para Ensaios de Placas Virais

Resumo

Fonte: Baer, A. e Kehn-Hall, K. Determinação da Concentração Viral por Ensaios de Placa: Utilizando Sistemas de Cobertura Tradicionais e Inovadores. J. Vis. Exp. (2014).

Este vídeo demonstra o uso de uma cobertura líquida à base de celulose microcristalina em um ensaio baseado em placas, comparando sua eficácia na formação de placas virais com a de uma cobertura tradicional de agarose semissólida.

Protocolo

1. Preparação de células e reagentes

1. No dia anterior ao ensaio, plaque as células hospedeiras apropriadas para o vírus em questão (Tabela 1 e Tabela 2) com confluência de 90 a 100%.
2. Prepare uma solução fixadora contendo 10% de formaldeído em H₂O. Por exemplo, misture 5,56 ml de formaldeído estoque a 36% com 14,44 ml de H₂O destilada (dH₂O).
   NOTA: Utilize práticas apropriadas de manipulação segura e ventilação ao usar formaldeído.
3. Prepare a coloração com violeta cristal: 1% de violeta cristal (CV) em etanol a 20% e dH₂O.
4. Prepare o meio de placa 2x (concentração dependente do tipo celular, 2x; consulte a Tabela 2). Filtre utilizando um filtro de 0,2 µm caso algum reagente não seja estéril.
5. Preparação de coberturas imobilizantes (Tabela 3)
   1. Para coberturas líquidas, prepare uma solução estéril de 2,4% de Avicel em dH₂O. Para evitar aglomeração, adicione o pó a um frasco contendo água que esteja sendo agitada rapidamente com um bastão de agitação, despeje o Avicel lentamente e agite vigorosamente à temperatura ambiente (TA). Quando a solução ficar muito viscosa para ser homogeneizada com o bastão de agitação, mude para um agitador de frascos por >30 min com agitação intensa para garantir homogeneização uniforme.
      NOTA: Soluções estoque podem ser preparadas em concentrações menores, mas podem separar-se e precisarão ser remixadas para assegurar homogeneização. Soluções de trabalho de Avicel podem ser usadas na faixa de 0,6-3%.
   2. Após a homogeneização, autoclave a solução e armazene-a fechada à temperatura ambiente (TA).
   3. Para coberturas de agarose e carboximetilcelulose (CMC), prepare uma solução estoque em dH₂O contendo 2% de CMC ou 0,6% de agarose. Misture com um bastão de agitação e autoclave ou aqueça em micro-ondas até completa dissolução.

2. Diluições e infecções

1. No dia seguinte ao plaqueamento, verifique visualmente a confluência e a viabilidade das células antes de iniciar o ensaio. Certifique-se de que a morfologia celular esteja normal e de que haja uma monocamada com cerca de 90% de confluência.
2. Realize uma diluição seriada decimal das amostras infecciosas. Utilize o meio de crescimento celular para propagação viral como diluente (Tabela 2). Ajuste o número de diluições conforme o título esperado do vírus em questão e sempre utilize uma amostra controle não infectada para garantir independentemente a viabilidade celular e auxiliar na identificação das placas.
3. A partir das diluições seriadas, infecte as células por 45 min a 1 hr (Tabela 1). Use um volume suficiente do inóculo para cobrir as células, mantendo o volume o mais baixo possível para maximizar o contato viral com a monocamada (Tabela 4). Agite suavemente as placas a cada 20 min para garantir uma cobertura uniforme e evitar que a monocamada celular seque.
4. Após a infecção, adicione diretamente ao inóculo no poço um volume apropriado de meio imobilizante (Tabela 2), utilizando uma mistura 1:1 de meio de placa 2x e o meio de sobreposição escolhido (CMC, agarose ou Avicel). Agite suavemente para homogeneizar.
   1. Para sobreposições líquidas, misture 1:1 meio de placa 2x aquecido com estoque de Avicel a 1,2 - 2,4% em temperatura ambiente para obter uma solução de trabalho com 0,6-1,2% de meio de sobreposição com Avicel.
   2. Para sobreposição com agarose, use uma mistura 1:1 de meio de placa 2x aquecido e uma solução estoque de agarose a 0,6% aquecida, colocando-a em banho-maria a 56 °C por 30 min para equilibrar a temperatura, obtendo uma concentração final de 0,3% de agarose/sobreposição.
   3. Para CMC, prepare uma solução estoque a 2% e trate conforme descrito para a sobreposição com agarose.
   4. Ao aplicar a sobreposição na monocamada, equilibre sempre a agarose quente ou o CMC em água a 56 °C para evitar danos à monocamada. Certifique-se de que a solução esteja morna, mas não quente ao toque, para prevenir a morte celular e redução nos títulos virais. A maioria das sobreposições com agarose começa a solidificar abaixo de 42 °C; trabalhe rapidamente e/ou prepare pequenos lotes para evitar solidificação durante o manuseio.
5. Após a adição da sobreposição, incube as placas para produzir placas distintas e claramente contáveis. A formação de placas pode levar de 2 a 14 dias, dependendo do vírus analisado (Tabela 1).
   NOTA: Após colocar as placas com sobreposição líquida no incubador, não as movimente. O deslocamento das sobreposições líquidas durante o período de incubação resultará em placas borradas. As sobreposições com agarose e CMC são semissólidas e podem ser movimentadas ou examinadas periodicamente ao microscópio óptico para monitorar o desenvolvimento das placas.

3. Fixação e coloração de células

1. Para fixar as células, descarte ou aspire a cobertura de Avicel e fixe as células utilizando a solução de formaldeído a 10% por 30 minutos a durante a noite (<1 ml por poço para uma placa de 6 poços).
   1. Para agarose ou CMC, adicione diretamente a solução de formaldeído à cobertura por 1 hora a durante a noite.
      NOTA: As amostras podem ser mantidas por longos períodos no fixador, desde que este não evapore e seque, pois isso pode distorcer a monocamada.
2. Antes da coloração e após a fixação, descarte o formaldeído e remova os tampões semissólidos de agarose e CMC com água corrente ou manualmente com uma espátula. Enxágue as placas de Avicel com água para remover o resíduo da cobertura/fixador antes da coloração.
3. Para a coloração, cubra as células com uma quantidade mínima de solução de violeta cristal por cerca de 15 minutos. Agite suavemente as placas, se necessário, para garantir uma cobertura uniforme.
4. Lave suavemente o corante violeta cristal com água. Uma vez fixadas, coradas e secas, as placas podem ser armazenadas indefinidamente para análises futuras.

Tabela 1. Condições de Inoculação e Tipos de Células no Ensaio de Placas

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de célula	Vero	Vero	MDCK
Período de infecção	1 hr	1 hr	45 min
Tempo de incubação	3 dias	2 dias	3 dias

 

Tabela 2. Meios de crescimento celular e viral e de placas

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de Célula	Vero	Vero	MDCK
Tipo de Crescimento	DMEM1	DMEM1	DMEM2
Meio de Placa	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. Meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal, 1% de L-Glutamina, 1% de Penicilina/Estreptomicina.

2. Meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco suplementado com 1% de L-Glutamina, 1% de Penicilina/Estreptomicina, 0,2% de Albúmina Sérica Bovina, 0,025% de HEPES, DEAE-Dextrana 50ug/ml.

A. Meios Mínimos Essenciais 2x (500 ml) suplementados com 5% de SBF (25 ml), 1% de Aminoácidos Mínimos Essenciais (5 ml), 1% de Piruvato de Sódio (5 ml), 1% de L-Glutamina (5 ml), 2% de Pen/Strep (10 ml).

B. Meios Mínimos Essenciais 2x (500 ml) suplementados com 0,2% de Albúmina Sérica Bovina, 1% de Aminoácidos Mínimos Essenciais (5 ml), 50 µg/ml, 0,025% de HEPES, DEAE-Dextrano, Tripsina-TPCK*

*Imediatamente antes da preparação, adicione 1 µl por 25 ml de uma solução estoque de 2 µg/ml de tripsina TPCK ao alíquota que você utilizará para misturar com agarose para as placas.

Tabela 3. Estoque de coberturas

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de célula	Vero	Vero	MDCK
Período de infecção	1 hr	1 hr	45 min
Tempo de incubação	3 dias	2 dias	3 dias

 

Tabela 4. Formatos das Placas

	6 poços	12 poços	96 poços
Número de células por poço	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
Volume do inóculo (μl)	400	200	50
volume da cobertura (ml)	3	1.5	0.100

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
violeta cristal	Sigma Aldrich	C3886-25G
Solução de formaldeído	Sigma Aldrich	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Agite vigorosamente ao reconstituir para >30 min para homogeneizar
UltraPure agarose	Invitrogen	16500-100
Carboximetilcelulose, sal sódica, viscosidade média	Sigma Aldrich	C4888