Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

Resumo

O cálcio é um mensageiro onipresente no sistema nervoso, essencial para desencadear a liberação de neurotransmissores e as alterações na força sináptica. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar Ca ^{2 +-indicadores} em terminais nervosos Drosophila. Nós também demonstram a fabricação dos aparelhos necessários e enfatizar os pontos críticos para o sucesso da técnica.

Resumo

Cálcio desempenha muitas funções no sistema nervoso, mas nenhum mais impressionante do que como o gatilho para a liberação do neurotransmissor, e ninguém mais profundo do que como o mensageiro essencial para a plasticidade sináptica que apoie a aprendizagem e memória. Para melhor elucidar as bases moleculares de Ca ^{2 +} dependentes de mecanismos sinápticos, um sistema modelo é necessário que seja geneticamente maleável e fisiologicamente acessível. Drosophila melanogaster fornece um modelo desse tipo. Neste sistema, geneticamente codificados indicadores fluorescentes estão disponíveis para detectar Ca ^{2 +} mudanças nas terminações nervosas. No entanto, estes indicadores têm limitada sensibilidade ao Ca ^{2 +} e muitas vezes mostram uma resposta não linear. Sintética indicadores fluorescentes são mais adequadas para medir a rápida Ca ^{2 +} mudanças associadas com a atividade do nervo. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar dextran-conjugados sintéticos Ca ^{2 +} indicadores em terminais nervosos viver em larvas de Drosophila. Ênfase particular é colocada sobre os aspectos do protocolo mais críticos para o sucesso da técnica, como forma de evitar descargas de eletricidade estática ao longo dos nervos isolados, manter a saúde da preparação durante os períodos de carga estendida, e garantindo a sobrevivência do axônio, fornecendo Ca ^{2 +} para promover a vedação de terminações dos axônios cortados. Baixa afinidade dextran-conjugados Ca ^{2 +-indicadores,} como a fluo-4 e Rhod, estão disponíveis, que mostram uma relação sinal-ruído alta, enquanto minimamente perturbar Ca ^{2 +} pré-sináptica dinâmica. Dextran conjugação-ajuda a prevenir Ca ^{2 +} indicadores sendo seqüestrado em organelas como as mitocôndrias. A técnica de carregamento pode ser aplicado igualmente para as larvas, os embriões e adultos.

Protocolo

1. Selecione um prato de dissecação limpa que não tenha sido exposto a qualquer fixadores.
   
   
2. Dissecar um errante 3 ^º instar larva Drosophila em Meio Schneider Drosophila contendo Ca ^{2 +} e L-glutamina, (não cortar qualquer nervos ou fibras musculares danos n º s 7, 6, 13 ou 12).
   
   
3. Selecione um copo de enchimento da pipeta com uma ponta de 12 mícrons (diâmetro interno).
   
   
4. Usando uma seringa e tubos (para aplicar pressão negativa para a pipeta) garantir que a ponta da pipeta não está obstruído.
   
   
5. Selecione um plástico fino filamento de enchimento que podem ser inseridos ao longo do comprimento da pipeta de vidro.
   
   
6. Desenhe ~ 1 cm de 5 mM dextran-conjugados Ca ^{2 +-indicador} para o filamento de plástico.
   
   
7. Cortar todos os nervos segmento.
   
   
8. Apoio a pipeta em uma rampa que irá permitir a ponta da pipeta a abordagem da linha média ventral da larva dissecados.
   
   
9. Desenhe o corte final de um nervo para o segmento No.4, sem comprimindo o nervo, na extremidade da pipeta (incluir uma pequena quantidade de meio Schneider).
   
   
10. Remova o tubo e insira o filamento de plástico para a pipeta até o final do filamento é dentro de 50 microns do fim do corte do nervo (evitar tocar o nervo).
    
    
11. Eject suficiente Ca ^{2 +-indicador} para a terminação nervosa para aumentar o volume de meio a Schneider em cerca de 33% (concentração final deve ser <2mm). Importante - Este deve ser concluída dentro de 5 minutos de cortar o nervo.
    
    
12. Coloque a preparação no escuro à temperatura ambiente, enquanto as cargas do nervo.
    
    
13. Após 40 minutos retire o Ca ^{2 +} indicador usando o filamento.
    
    
14. Deixe a pipeta no lugar e preenchê-lo completamente com o meio Schneider fresca, como isto será usado para aplicar pulsos estimulantes para o nervo.
    
    
15. Permitir que o Ca ^{2 +} indicador de equilibrar no nervo por pelo menos 60 minutos, mas não mais do que 4 horas, antes de iniciar Ca ^{2 +-imagem.}
    
    
16. Lavar a preparação com meio fresco Schneider cada 30 minutos enquanto ele é equilibrante.
    
    
17. 20 minutos antes de substituir o meio de imagens Schneider com hemolinfa-Like solução No.6 (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).
    
    
18. L-ácido glutâmico ou glutamato podem ser adicionados a HL6 solução a 7mm para dessensibilizar os receptores pós-sinápticos do glutamato para evitar nervo evocadas contração muscular (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Schneider’s Insect Medium	Reagente	Sigma-Aldrich	S0146	deve conter L-glutamina e cálcio
sal monossódico de ácido L-glutâmico hidratado	Reagente	Sigma-Aldrich	G1626