Desenvolvimento precoce da mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é caracterizada por uma série de alterações nas células forma que são adequados para abordagens de imagem. Este artigo irá descrever as ferramentas básicas e métodos necessários para geração de imagens ao vivo confocal de embriões Drosophila, e incidirá sobre uma mudança a forma da célula chamada celularização.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento de Drosophila melanogaster embrião passa por uma série de alterações nas células de forma que são altamente suscetíveis a viver de imagem confocal. Alterações nas células forma no fly são análogas àquelas em organismos superiores, e eles dirigem morfogênese do tecido. Assim, em muitos casos, seu estudo tem implicações diretas para a compreensão de doenças humanas (Tabela 1) 1-5. Na escala sub-celular, essas mudanças forma da célula são o produto de actividades que vão desde a expressão do gene de transdução de sinal, polaridade celular, a remodelação do citoesqueleto e do tráfico de membrana. Portanto, o embrião Drosophila fornece não só o contexto para avaliar mudanças no formato da célula como eles se relacionam com a morfogênese do tecido, mas também oferece um ambiente completamente fisiológica para estudar as atividades sub-celular que as células forma.
O protocolo aqui descrito foi concebido para uma mudança de imagem forma específica de células chamado celularização. Celularização é um processo de crescimento dramático da membrana plasmática, e em última análise, converte o embrião sincicial no blastoderma celular. Ou seja, a interfase do ciclo mitótico 14, a membrana plasmática invagina simultaneamente em torno de cada um dos núcleos ~ 6000 corticalmente ancorado para gerar uma folha de células epiteliais primárias. Contador para sugestões anteriores, celularização não é impulsionado por Miosina-2 contratilidade 6, mas em vez disso é alimentado em grande parte por exocitose da membrana interna das lojas 7. Assim, celularização é um excelente sistema para estudar o tráfico de membrana celular durante as mudanças de forma que necessitam de invaginação da membrana plasmática ou de expansão, tais como citocinese ou transversal dos túbulos (túbulos T) morfogênese no músculo.
Note que este protocolo é facilmente aplicado à imagem de outras alterações de células forma no embrião da mosca, e só requer pequenas adaptações, como mudar o estágio de colheita de embriões, ou usar "cola embrião" para montar o embrião de uma orientação específica (Tabela 1) 19/08. Em todos os casos, o fluxo de trabalho é basicamente o mesmo (Figura 1). Métodos padronizados para a clonagem ea transgenia Drosophila são usados para preparar ações mosca de estábulo que expressam uma proteína de interesse, fundida a proteína verde fluorescente (GFP) ou suas variantes, e estas moscas fornecer uma fonte renovável de embriões. Alternativamente, as proteínas fluorescentes / sondas são introduzidas diretamente em embriões de voar através de injeção direta micro-técnicas 9-10. Então, dependendo do evento de desenvolvimento e mudança de células forma a ser trabalhada, os embriões são recolhidos e encenado pela morfologia em um microscópio de dissecação e, finalmente, posicionados e montados de lapso de tempo imagem em um microscópio confocal.
Protocolo
1. Montar Copas de colheita de embriões
- Corte fora o fundo de um copo 100 mL Tri-milho, com uma lâmina de barbear, tornando a borda mais suave possível. Os copos são mais fáceis de lidar se você também aparar as três cantos fora do topo, embora isso não seja absolutamente necessário.
- Corte um quadrado de tela de arame (6 cm x 6 cm). Em um prato pré-aquecido quente, dentro de uma camada de fumaça capô, a praça de malha de arame em cima de um pedaço de pesados folha de alumínio. Empurre a borda inferior do corte do copo firmemente na malha quente. Aguarde alguns segundos e levantar a taça com a malha agora anexado. Se a folha também varas, apenas....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo aqui descrito permitirá a criação de imagens, ao vivo confocal de uma série de mudanças no formato da célula do embrião voar em desenvolvimento. GFP ações para geração de imagens pode ser preparado por um laboratório individual (Tabela 2), mas muitas dessas populações também estão à disposição do público de centros como Bloomington Drosophila stock Centro da Universidade de Indiana ( http://flystocks.bio.indiana.edu ) e Flytrap Centro de estoque na Univ.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos Eric Wieschaus, que forneceu a base sobre a qual este protocolo foi desenvolvido. Nosso trabalho é apoiado por uma Verna & Marrs McLean Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular Start-up Award, Baylor College of Medicine.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâminas | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Lâminas de cobertura 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| Garrafas com bico (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| Tubos Falcon de 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Bulbos para pipetas pequenas, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Frascos de cintilação com tampas | VWR international | 66021-533 | |
| Béqueres Tri-Corn, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| Placa de Petri BD Falcon 60x15 mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| Filtro celular BD Falcon | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Pontas de pipeta amarelas | Rainin | L200 | |
| Malha de aço inoxidável, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| Pipetas Pasteur de vidro 5¾ polegadas | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Papel filtro P4 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| Elásticos | Office Max | A620645 | |
| Fita adesiva dupla face Scotch, ½ polegada | Office Max | A8137DM-2 | |
| Pincéis para pintura Robert Simmons Expression E85 redondo nº 2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Pinça Dumont nº 5, Alta Precisão Inox | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| Lâminas de barbear | VWR international | 55411-050 | |
| Óleo de Halocarbono 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| Heptano | Fisher Scientific | H360-1 | |
| Ágar BD Bacto | VWR international | 90000-760 | |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Ácido p-hidroxibenzoico | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Levedura seca ativa Red Star | LeSaffre | 15700 | |
| Toalhas de papel, dobra C | Kleenex | ||
| Folha de alumínio pesada | Reynolds Wrap | ||
| Água sanitária | Austin’s A-1 Commercial | ||
| Suco de maçã 100% | Ocean Spray ou Tree Top |
Referências
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., G....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
