Experimento Perfil bioenergética usando células C2C12 mioblastos

Resumo

A descrição de um método para caracterização da função mitocondrial em células é fornecido. O perfil mitocondrial gerado fornece quatro parâmetros da função mitocondrial, que pode ser medido em um experimento: taxa de respiração basal, ATP-linked respiração, vazamento de prótons, e capacidade de reserva.

Resumo

A capacidade de medir o metabolismo celular e compreender a disfunção mitocondrial, permitiu que os cientistas em todo o mundo para fazer avançar a sua investigação na compreensão do papel da função mitocondrial em obesidade, diabetes toxicidade, envelhecimento, câncer, função cardiovascular e segurança.

Metabolismo celular é o processo de absorção do substrato, tais como oxigênio, glicose, ácidos graxos, e glutamina, e subseqüente conversão de energia através de uma série de oxidação enzimática controlada e as reações de redução. Estas reações bioquímicas intracelulares resultam na produção de ATP, a liberação de calor e produtos químicos derivados, tais como lactato e CO ₂ no ambiente extracelular.

Informações valiosas sobre o estado fisiológico das células, ea alteração do estado das células, pode ser adquirida através da medição da taxa de oxigênio consumido pelas células, um indicador da respiração mitocondrial - a Taxa de Consumo de Oxigênio - ou OCR. Células também gerar ATP através da glicólise, ou seja: a conversão de glicose em lactato, independente do oxigênio. Em poços de cultura, o lactato é a principal fonte de prótons. Medindo o ácido láctico produzido indiretamente através de prótons lançado no meio extracelular em torno das células, o que provoca a acidificação do meio fornece a taxa de acidificação extra-celular - ou ECAR.

Neste experimento, as células C2C12 mioblastos são semeados a uma densidade dada em placas de cultura de células Seahorse. O consumo de oxigênio basal (OCR) e extracelular acidificação (ECAR) taxas são medidas para determinar as taxas de referência. As células são então metabolicamente perturbado por três adições de compostos diferentes (em sucessão), que mudar o perfil da bioenergética celular.

Este ensaio é derivado de uma experiência clássica para avaliar a mitocôndria e serve como um quadro com o qual construir experiências mais complexas como objetivo compreender a função tanto fisiológicas e fisiopatológicas das mitocôndrias e para prever a habilidade das células de responder ao estresse e / ou insultos.

Protocolo

Neste experimento, as células C2C12 mioblastos são semeados a uma densidade dada em placas de cultura de células Seahorse. O consumo de oxigênio basal (OCR) e extracelular acidificação (ECAR) taxas são medidas para determinar as taxas de referência.

1. Injeção de células

As células são metabolicamente perturbado por três adições de compostos diferentes (em sucessão), que mudar o perfil da bioenergética celular. Um grupo servirá de controle, com execução de mídia adicionado como controle de "compostos".

1. A primeira injeção é oligomicina. Oligomicina inibe a síntese de ATP através do bloqueio do canal de prótons da porção F _o ATP sintase (V Complex). Na pesquisa mitocondrial, que é usado para prevenir o estado 3 (fosforilar) respiração. Com células, ele pode ser usado para distinguir o percentual de consumo de O2 dedicado à síntese de ATP eo percentual de consumo de O2 necessária para superar o vazamento de prótons naturais através da membrana mitocondrial interna.
2. A segunda injeção é FCCP. FCCP (carbonil cianeto-p-Trifluormetoxifenilidrazona) é um ionóforo que é um transportador de iões móveis. É um agente desacoplamento porque rompe com a síntese de ATP, transportando íons de hidrogênio através da membrana mitocondrial, em vez do canal de prótons da ATP sintase (V Complex). Este colapso do potencial de membrana mitocondrial leva a um rápido consumo de energia e oxigênio, sem a geração de ATP. Neste caso, tanto OCR e ECAR irá aumentar, devido ao desacoplamento do OCR, e ECAR como as células tentativa de manter seu balanço energético por meio da glicólise para gerar ATP.
   FCCP tratamento pode ser usado para calcular a capacidade respiratória "reposição" de células que é definida como a diferença quantitativa entre máxima OCR descontrolada eo OCR inicial basal. Tem sido proposto que a manutenção de alguma capacidade respiratória, mesmo em condições de estímulo fisiológico ou fisiopatológico máxima é um fator importante que define a vitalidade e / ou sobrevivência de células. A capacidade das células de responder ao estresse em condições de crescente demanda de energia é em grande parte influenciado pela capacidade bioenergética de mitocôndrias. Esta capacidade bioenergética é determinada por vários fatores, incluindo a capacidade da célula para fornecer substrato para a mitocôndria e da capacidade funcional de enzimas envolvidas no transporte de elétrons
3. Na terceira injecção, rotenona, um inibidor do Complexo I, é adicionada às células. Isto irá desligar a respiração mitocondrial e permitir que tanto as frações mitocondrial e não contribuindo para a respiração mitocondrial deve ser calculado. Observa-se uma diminuição no OCR, devido à função mitocondrial danificada, com um aumento concomitante ECAR como a célula passa para um estado mais glicolítica, a fim de manter seu balanço energético
   Rotenona é um inibidor mitocondrial que impede a transferência de elétrons do centro Fe-S no Complexo I ubiquinona (coenzima Q). Esta inibição do Complexo I impede a energia potencial em NADH de ser convertida em energia utilizável na forma de ATP.
   

2. Reagentes e materiais

1. Oligomicina, FCCP, e Soluções de rotenona (Seahorse Mito Kit Stress Test)
2. DMEM Executando Media (Seahorse # 100965-000)
3. DMSO (Sigma D8418)
4. Água destilada (Gibco 15230-170)
5. Tampão de calibração (Seahorse Bioscience)

3. Meio de Crescimento

1. 500 mL DMEM (Gibco 11965-092)
2. FBS 10% (Hyclone SH90070.03)
3. 5 mL Penn / Strep (Gibco 15140-122)
4. 5 mL piruvato de sódio (Sigma S8636)
5. 5 mL Glutamax (Gibco 35050-061)

4. Semeadura Protocolo

1. Células são semeadas em culturas de células XF96 placas com 10.000 células / poço em 100 mL de meio de crescimento e colocou em 37 ° C incubadora com 10% de CO _2.
2. Células irão aderir à placa de cultura de células XF96 dentro de 1 hora.
3. Ensaio em células XF96 24 horas após a semeadura.

5. Elaboração de modelos de Ensaio

1. Usando o Assistente de Ensaio (Anexo I), gerar um modelo com o esquema seguinte grupo:
   
   Figura 1. Layout de grade Bem identificar atribuições coluna e do grupo

6. Preparação composto

1. Prepare os seguintes compostos na XF DMEM Ensaio de mídia da seguinte forma:
   10 oligomicina uM, 30,0 uM FCCP, 20,0 mM rotenona,
   Estas concentrações representam a diluição de 10X que serão feitas quando os compostos são injetados dentro do poço. As concentrações de trabalho são:
   1 oligomicina uM, 3,0 uM FCCP, 2,0 mM rotenona

7. Mudança de mídia e preparação celular

Coloque a placa de célula na Prep XF Station
1. Definir o volume final de média a 160 mL por poço.
2. Incubar 37 ° C em incubadora de CO ₂ sem por 60 minutos para permitir que as células pré-equilibrar com o meio de ensaio.

8. Como carregar o cartucho Sensor

1. Compostos quente a 37 ° C antes de carregar cartucho de sensor de carga e os compostos nas portas injector da seguinte forma:
   1. Colunas 1-4: Carga 16, 18 e 20 mL de XF Assay media (DMEM) em portos A, B e C, respectivamente.
   2. Colunas 5-12:
      16 mL de carga nos portos A oligomicina
      18 mL de carga em portos FCCP B
      Carga de 20 mL de rotenona em portos C

9. Comandos protocolo

Comando	Tempo (min)	Porto
Calibrar
Equilibrar
Loop Start	3X
Mistura	3
Esperar	2
Medida	3
Loop End
Injetar		A
Loop Start	2X
Mistura	3
Esperar	2
Medida	3
Injetar		B
Loop Start	2X
Mistura	3
Esperar	2
Medida	3
Injetar		C
Loop Start	2X
Mistura	3
Esperar	2
Medida	3
Final

Comandos da tabela 1. Protocolo

Discussão

Este ensaio é derivado da experiência clássica para sondar a função mitocondrial e serve como um quadro com o qual construir experiências mais complexas como objetivo compreender várias mudanças no metabolismo celular, a função mitocondrial, e bioenergética global.

Todos os compostos utilizados neste experimento devem ser otimizados para a concentração que proporciona o efeito máximo. Ou seja, deve-se realizar experimentos de titulação separado para verificar esses valores. Isto é especialmente importante com FCCP, como a curva de titulação tende a ser bastante acentuada, e FCCP em excesso pode realmente diminuir as respostas em OCR. Intervalos típicos (concentração final) para teste seria:

• 0,1-1,0 ug / mL de oligomicina
• 0,1-5,0 uM FCCP
• 0,1-1,0 rotenona uM

Note-se que as respostas a cada composto acima (especialmente FCCP) será influenciada pela composição do ensaio de mídia (tipo base, [glicose], [piruvato], presença / ausência de BSA, etc). Além disso, se o ensaio XF composição media é alterada, otimização terá de ser re-executadas. A presença e concentração de piruvato é especialmente importante na obtenção da capacidade respiratória máxima, devido à FCCP. Seahorse Bioscience tem observado em um número de linhas de células que omissão de piruvato anula a capacidade das células para responder ao máximo (acima de linha de base) para FCCP. Tipicamente, as concentrações de piruvato mM 10/01 deve ser testado para entender a melhor concentração de piruvato para obter a respiração máxima. Note-se que [piruvato] e [glicose] pode ser necessário "cross-titulada" para obter as condições ideais de mídia para o experimento.

Os resultados típicos deste experimento são apresentados a seguir em um gráfico que mostra OCR vs tempo e outro mostrando ECAR versus tempo:

Figura 2. OCR Tempo vs

Figura 3. ECAR Tempo vs

Aqui observamos as respostas esperadas em OCR e ECAR como as células são tratadas com cada composto sucessivas. Para oligomicina, OCR diminui como resultado do bloqueio da síntese de ATP mitocondrial no Complexo V. Uma vez que as células são incapazes de sintetizar ATP via OXPHOS, voltam a glicólise para atender à demanda de ATP, portanto, observamos um aumento na ECAR. Como mostrado anteriormente, FCCP atua como um agente desacoplamento. Uma vez que as células precisam agora superar o vazamento de prótons através da membrana mitocondrial interna, OCR aumenta significativamente a O2 é consumido mais para bombear o excesso de prótons de volta através da membrana mitocondrial. Finalmente, rotenona inibe mitocondrial Complexo I e Complexo III, respectivamente, o que faz com que o fluxo de elétrons para cessar na cadeia de transporte de elétrons e, assim, o consumo de O2 é reduzido drasticamente.

Figura 4. Respiração parâmetros

Além das alterações esperadas na respiração e ECAR, uma série de parâmetros respiratórios podem ser obtidas a partir destes dados. Isto é resumido na figura acima:

Aqui vemos que podemos obter informações sobre a respiração basal das células, o percentual de consumo de O2 dedicada à produção de ATP, bem como o montante atribuído para a manutenção do gradiente de prótons (H + devido ao vazamento). Além disso, podemos obter a taxa respiratórias máximas em condições de respiração desacoplado (por vezes referido como reposição da capacidade respiratória) e, finalmente, podemos determinar a quantidade de consumo de O2 não devido a processos mitocondriais.

Um número crescente de estudos estão empregando este perfil mitocondrial para avaliar bioenergética celular, identificar disfunção mitocondrial e para prever a habilidade das células de responder ao estresse e / ou insultos. Para mais informações e detalhes sobre este método experimental ea idéia de capacidade respiratória de reserva, por favor veja se referir as seguintes publicações ^1-8.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soluções de oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A	Seahorse Bioscience		Kit do Teste de Estresse Mitocondrial Seahorse
Meio de corrida DMEM	Seahorse Bioscience	100965-000
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Água destilada	GIBCO, por Life Technologies	15230-170
Tampão de calibração	Seahorse Bioscience