Artigo de método

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

DOI:

10.3791/2513

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21 de fevereiro de 2011

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1Department of Medicine, Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 2Cellular and Molecular Pathology, School of Medicine, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

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Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para o isolamento, cultura e expondo essas células à fumaça de cigarro mainstream, a fim de estudar as respostas moleculares para esta toxina ambiental.

Resumo

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Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface (ALI) como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para isolar e expor essas células à fumaça do cigarro convencional (CS), a fim de estudar as respostas das células epiteliais à exposição CS. O protocolo consiste em três partes: o isolamento de células epiteliais das vias aéreas a partir do mouse traquéia, o cultivo dessas células em ar-líquido interface (ALI) como totalmente diferenciada células epiteliais, ea entrega de calibrado principais CS a essas células em cultura. O sistema de cultura ALI permite a cultura do epitélio respiratório sob condições que se assemelham mais a sua configuração fisiológica do que sistemas de cultura comuns líquido. O estudo molecular de pulmão e respostas celulares à exposição CS é um componente crítico de compreensão do impacto da poluição do ar ambiente sobre a saúde humana. Resultados da investigação nesta área pode vir a contribuir para a compreensão da etiologia da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), e outras doenças tabaco-relacionadas, que representam grandes problemas de saúde global.

Protocolo

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O protocolo geral requer dois dias para isolamentos de células do tecido animal, 5-10 dias para a proliferação celular, e um adicional de 10-14 dias para a diferenciação de células no ar-líquido interface. Um dia adicional é necessário para exposições de células e colheita de amostras.

1. Isolamento de rato traqueobrônquica células epiteliais (MTEC).

Nota: Todos os procedimentos descritos abaixo foram analisados ​​e aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use em Brigham e do Hospital da Mulher / Área Harvard Medical School.

Antes de começar:

  • Prepare F12 Ham míd....

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Discussão

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O protocolo descrevendo o isolamento de células epiteliais do mouse traqueal é adaptado dos protocolos de Você et al., 1, 2-3 e outros com modificações. Como acontece com qualquer protocolo de isolamento de células descrevendo, o aspecto mais crítico é o de evitar a contaminação por patógenos, bacteriana ou fúngica, utilizando técnicas de assepsia rigorosa. Um segundo passo fundamental é evitar a contaminação das culturas de fibroblastos, que podem ser evitados por meio de dissecção cuidadosa das tra.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Agradecemos a Emeka Ifedigbo de assistência técnica e Shivraj Dr. Tyagi de conhecimentos valiosos. Agradecemos também o Centro NeuroDiscovery Harvard para a assistência com a microscopia. Este trabalho foi financiado em parte por uma Associação Americana do Coração Predoctoral conceder 09PRE2250120 para Hilaire Lam, e concede NIH, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, concedido a AMK Choi.

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Materiais

* A máquina de fumar cigarros é um costume projetou e fabricou 14 "x14" x20 "Dual septadas e à prova d'água tonalidade jacketed luz clara 1 / 2" de espessura de policarbonato Lexan câmara de exposição à fumaça do cigarro com sensor de temperatura controlada, nível de água controlado desligar do sistema. Um cigarro / puffing unidade está instalada por um cigarro variável puffing taxas. Quando a unidade estiver em uso, ele imita uma incubadora no sentido de que a temperatura, umidade e dióxido de carbono são controlados no sistema. O sistema inclui: (I) um personalizado unidade de câmara de água / dupla camisa que mantém um ambiente controlado para experimentos de cultura de tecidos. (II) O dever de um pesado digitais, de alta precisão dupla bomba de água do sistema de circulação de temperatura com sensor de nível de água e controle de temperatura (III) A unidade de cigarro fumando com bomba. (IV) Uma bomba de ciclo de sensor de controle de taxa de cycler (IV) A precisão em aço inoxidável de alta-Line no porta-filtro. (V) A tampa destacável montado 02/11 "tamanho axial uniformidade fã fumaça de cigarro de mistura. (VI) Um banho de água de médio porte com suporte de montagem para a circulação de água. (VII) A 1 / 2 'bandeja de acrílico de espessura com suportes para o bomba de sopro e suporte para coletor de cinzas de cigarro.

Esta máquina, como descrito pode ser substituído por máquinas similares disponíveis comercialmente fumar tais como o tipo disponível a partir de sistemas TSE ( www.tse-systems.com ).

Referências

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  1. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
  2. Davidson, D. J. Mur....

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