Montar toda In situ Hibridação (WISH) foi utilizado em um curso superior de Biologia Comparada de Vertebrados nível de graduação, além de vertebrados dissecções. Isso deu aos alunos a oportunidade de estudar padrões de expressão gênica, bem como anatomia, ligando o estudo da biologia molecular e do organismo dentro de um curso.
Artigo de método
Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Montar toda a hibridização in situ (WISH) é uma técnica comum em laboratórios de biologia molecular utilizadas para estudar a expressão do gene através da localização de transcrições de mRNA específicos dentro espécime montar todo. Esta técnica (adaptado de Albertson e Yelick, 2005) foi usado em um nível superior de graduação comparativa sala de aula Vertebrados laboratório de Biologia da Universidade de Syracuse. Os primeiros dois terços do comparativo de laboratório do curso de Vertebrados Biologia deram aos alunos a oportunidade de estudar a embriologia e anatomia dos diversos organismos que representam taxa chordate vários principalmente através dissecções tradicionais eo uso de modelos. A parte final do curso envolveu uma abordagem inovadora para ensinar anatomia através da observação do desenvolvimento dos vertebrados empregando técnicas moleculares em que WISH foi realizada em embriões do zebrafish. Um fator de crescimento de fibroblastos heterozigotos 8-A (fgf8a) linhagem mutante, ace, foi usado. Devido à herança mendeliana, ás intercrosses produzida tipo selvagem, heterozigoto, e os mutantes homozigotos ace/fgf8a em uma proporção de 01:02:01. Sondas de RNA com padrões de expressão conhecida na linha média e no desenvolvimento de estruturas anatômicas, como o coração, somitos, tailbud, miótomo e cérebro foram utilizados. WISH foi realizada utilizando zebrafish no somito 13 e prim-6 etapas, com os alunos realizar a reação de coloração em sala de aula. O estudo de embriões zebrafish em diferentes estágios de desenvolvimento deram aos alunos a capacidade de observar como estas estruturas anatômicas mudado ao longo da ontogenia. Além disso, alguns mutantes ace/fgf8a exibido looping coração imprópria, e defeitos em somito e desenvolvimento do cérebro. Os alunos neste laboratório observou o desenvolvimento normal de vários sistemas do órgão usando tanto a anatomia externa, bem como padrões de expressão gênica. Eles também identificaram e descreveram embriões exibindo desenvolvimento anatômico inadequado e de expressão gênica (ie, os mutantes putativos).
Para instrutores em instituições que ainda não possuem o equipamento necessário ou onde os fundos de laboratório e de inovação curricular são limitados, o custo financeiro dos reagentes e aparelhos pode ser um fator a considerar, assim como o tempo eo esforço necessário por parte do instrutor, independentemente da configuração. No entanto, sustentamos que o uso de WISH neste tipo de ambiente de laboratório em sala de aula pode proporcionar uma importante ligação entre a genética do desenvolvimento e anatomia. Com o avanço da tecnologia ea capacidade de estudar o desenvolvimento do organismo em nível molecular se torna mais fácil, mais barato e cada vez mais popular, muitos biólogos evolutivos, ecologistas e fisiologistas estão se voltando para estratégias de pesquisa no campo da biologia molecular. Usando WISH em um comparativo de sala de aula de laboratório de Vertebrados Biologia é um exemplo de como as moléculas e anatomia podem convergir em um único curso. Isso dá a estudantes universitários de nível superior a oportunidade de praticar as modernas técnicas de pesquisa biológica, levando a uma educação mais diversificada e a promoção da investigação interdisciplinar futuro científico.
Protocolo
1. Transformação plasmídeo do Target cDNA
Parte I: Transformação de Plasmid
(Tempo necessário: 3 horas mais de incubação durante a noite)
- Caldo quente SOC nutrientes em um banho de água 42 ° C (500 mL por reação)
- Descongele as células competentes sobre o gelo
- Adicionar 1 mL a 25 mL plasmídeo células competentes
- Colocar no gelo por 20 minutos
- Calor células de choque em 42 banho de água ° C por 45 segundos
- Colocar imediatamente as células no gelo por 2 minutos
- Adicionar 500 mL de 42 ° C caldo de nutrientes para cada frasco de células
- Agite a 37 ° C por 2 horas a 255 rotações por minuto (rpm)
- Placa 75 mL mix de transformação em Luria Bertani placas (LB) ágar
- Incubar as placas invertidas a 37 ° C durante a noite
Parte II: E. Cultura coli
(Tempo necessário: 15 minutos acrescido de incubação durante a noite)
- Para cada reação, 3 alíquota caldo LB mL e 3 mL de 50 mg / mL ampicilina em um tubo de cultura
- Raspe uma colônia de bactérias da placa de agar e adicionar a cada tubo de cultura
- Agitar tubos de cultura a 37 ° C em 255 rpm durante a noite
Parte III: Prep Plasmid
(Tempo necessário: 1,5 horas)
- Isolar plasmídeo de culturas durante a noite usando o Kit 5 Mini Prime FastPlasmid (Catalog # 2300000)
- Para verificar a presença de plasmídeo preparada, execute o DNA eluído do kit em um gel de 1% Tris-acetato-EDTA (TAE) corado com brometo de etídio
2. In Situ DIG marcado Síntese da sonda RNA
Parte I: Linearização de Plasmid
(Tempo necessário: 2,5 horas)
- Em um microtubo de 1,5 mL, combine:
Preparado Plasmid 20 mL * Enzima de restrição 2 mL Tampão ** 10 mL 10X albumina bovina (BSA) 10 mL Dietil Pyrocarbonate Água (DEPC) 58 mL 100 mL - Incubar a 37 ° C por 2 horas
* Varia de acordo com plasmídeo
** Varia de acordo com enzima de restrição
Parte II: Transcrição
(Tempo necessário: 3 horas)
- Em um microtubo de 1,5 mL, combine:
Linear Plasmid 4 mL Tampão Transcrição 10X ** 4 mL Digoxigenina Mix Etiqueta 4 mL * Polimerase 2 mL Inibidor de RNase 2 mL Água DEPC 24 mL 40 mL - Incubar a 37 ° C por 1 hora
- Adicione 2 mL da polimerase *
- Incubar a 37 ° C por 1 hora
- Adicione 2 mL de DNase
- Incubar a 37 ° C por 20 minutos
* Varia de acordo com plasmídeo
** Varia de acordo com polimerase
Parte III: Precipitação
(Tempo necessário: 5 minutos mais duas horas de incubação durante a noite, uma hora para outra centrífuga e re-suspensão)
- Adicionar 4 mL de EDTA 0,2 M
- Adicionar 5 mL de cloreto de lítio 4M
- Adicionar 150 mL de etanol 100% gelado
- Incubar a -80 ° C por 2 horas durante a noite
- Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, embora decante o sobrenadante
- Pellet seco por 7 minutos
- Re-suspender em 20 mL de água DEPC
- Incubar a 37 ° C por 5 minutos
Parte IV: Fracionamento - Executar apenas se o tamanho da sonda é superior a 0,6 kb
(Tempo necessário: Varia com base no tamanho da sonda, geralmente não mais de 20 minutos)
- Em um microtubo de 1,5 mL, combine:
RNA Probe 20 mL Água DEPC 12 mL Bicarbonato de sódio 4 mL Carbonato de Sódio 4 mL 40 mL - Incubar em banho-maria a 60 ° C. O tempo de incubação de base na seguinte equação:
Tempo (min.) = (partida kb - desejado kb) / (0,11 x de partida kb x desejado kb)
Tamanho desejado média = 0,6 kb
Parte V: Precipitação final
(Tempo necessário: 5 minutes mais duas horas de incubação durante a noite, uma hora para outra centrífuga e re-suspender, 1 hora para eletroforese em gel)
- Adicionar 40 mL de água DEPC
- Adicionar 8 mL de acetato de sódio
- Adicionar 1,04 mL de ácido acético glacial
- Adicionar 240 mL de gelo etanol frio a 100%
- Incubar a -80 ° C por 2 horas durante a noite
- Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, embora decante o sobrenadante
- Pellet seco por 7 minutos
- Re-suspender em 20 mL de água DEPC
- Vortex para misturar
- Para verificar a presença de riboprobe, executar a solução re-suspensas em um gel corado 1% TAE com brometo de etídio
3. Monte todo Hibridização In Situ
Parte I: A fixação de embriões e proteinase K Digestão
(Tempo necessário: Fix horas durante a noite, mais 4 no dia seguinte para o armazenamento, 2,5 horas de armazenamento com a Parte II)
- Coletar embriões encenado zebrafish e corrigir em paraformaldeído 4% (PFA) durante a noite a 4 ° C
- Lavar embriões fixados em tampão fosfato salina contendo 0,1% Tween-20 (PBST) 3 vezes por 10 minutos cada
- Para garantir a exposição dos embriões aos reagentes experimental, embriões dechorionate manualmente (se necessário) usando uma pinça de ponta fina
- Desidratar embriões por lavagem em uma série graduada de 25% e metanol 50% em PBST por uma hora cada lavagem, em seguida, armazenar em metanol 100% a -20 ° C
- Quando estiver pronto para uso, reidratar embriões em PBST por lavagem em 50% (2 vezes) e 25% (1 vez) de metanol em PBST por 10 minutos cada. Finalmente, lavar 2 vezes durante 10 minutos cada, em PBST 100%. Momento exato não é importante para PBST / metanol lava
- Bleach embriões em uma solução de peróxido de hidrogênio 10% em PBST, se necessário, para remover os pigmentos escuros. Embriões devem incubar em solução de peróxido de hidrogênio por 10-20 minutos, dependendo da idade do embrião, ea tampa do tubo de microcentrífuga deve permanecer aberta para evitar acumulação de pressão de ar
- Embriões Digest com 50 mg / mL de Proteinase K diluído 1:5000 em PBST de 15/03 minutos, dependendo da idade do embrião
- Re fix-embriões em PFA 4% por 30 minutos, e depois lave 3 vezes em PBST por 5 minutos cada
Parte II: A hibridação de Riboprobes
(Tempo necessário: 3 horas mais durante a noite para hibridação, 1,5 horas no dia seguinte com a Parte III)
- Prehybridize embriões com solução prehybridization (PHS), em pré-aquecido a 70 · Banho de água C por 2-3 horas
- Remover PHS, adicionar 0,5 mL de solução de hibridização e 1,5 mL previamente sintetizado digoxigenina riboprobes rotulados, incubar a 70 ° C durante a noite. Temperatura poderá variar dentro de alguns graus, dependendo do alvo riboprobe
- No dia seguinte, lave embriões a 70 ° C em soluções graduais de 75%, 50% e 25% PHS em citrato de sódio, solução salina 2X (SSC) por 10 minutos cada, em seguida, lave em 0,2 X SSC por 30 minutos a 68 ° C
- Lavar em tampão de ácido maleico (MAB) 2 vezes por 10 minutos cada em temperatura ambiente
Parte III: Anti-digoxigenina (DIG-α) Incubação de anticorpos
(Tempo necessário: 3 horas mais durante a noite para bloco, 2,5 horas no dia seguinte com a Parte IV)
- Transferência de embriões para uma placa de 12 poços
- Bloco pré-embriões em solução mL 1-2 bloqueio por pelo menos 3 horas à temperatura ambiente
- Ao mesmo tempo, pré-bloco do anticorpo preparando um segundo volume de solução de bloqueio e diluindo o anticorpo anti-digoxigenina 1:2000 nesta solução
- Remover pré-bloco e adicionar 1-2 mL de pré-bloqueados solução α-DIG, incubar overnight a 4 ° C
- No dia seguinte, lave embriões no MAB. Permitir que os embriões para incubar no MAB por 5 minutos em primeiro lugar, em seguida, executar alterações no buffer e incubar por dois minutos 10, uma 30 minutos e um intervalo de 60 minutos. Momento exato não é necessário
- Lavar embriões 3 vezes por 5 minutos cada em tampão Fosfatase Alcalina (AP)
Parte IV: Coloração e Processamento Final
(Tempo necessário: uma hora durante a noite para a coloração, dependendo da riboprobe usado, quatro horas para o início de lavagens glicerol, 10/06 horas por lavagem de glicerol, podem ser armazenados em glicerol)
- Adicione 1-2 mL de solução de coloração para os embriões, embrulhe a placa em papel alumínio, e verificar a coloração em intervalos regulares (a cada 20 minutos) até que a coloração é suficiente
- Lavar embriões com PBST 2 vezes por 5 minutos cada um para parar a reação de coloração
- Desidratar embriões usando 10 lavagens minutos em 25% (1 vez) e 50% (2 vezes) metanol em PBST, em seguida, em metanol 100%, para remover a coloração de fundo
- Permitir que embriões para incubar em metanol 100% por pelo menos duas horas em temperatura ambiente
- Reidratar em PBST com 10 lavagens minutos em 50% (2 vezes) e 25% (1 vez) de metanol em PBST, em seguida, lave em 100% PBST 2 vezes
- Transferência e manchadambryos a uma solução de glicerol 80% em PBST, usando uma série graduada de lavagens, e armazenar a 4 ° C.
Receitas:
- Placas-10 LB agar agar LB g + 250 mL de água destilada, autoclave, quando fria ao toque juntar 250 mL ampicilina, despeje solução mL 15-20 quente em cada placa de Petri, permitem ágar para solidificar
- Caldo-12.5 LB caldo LB g + 200 mL de água destilada, autoclave, deixe esfriar antes de usar
- 1% TAE gel-agarose 0,4 g, 40 mL TAE 1X, 2 mL de brometo de etídio; carga 7 (Transformação Plasmid do Target cDNA) plasmídeo mL ou 3 mL riboprobe e 4 mL de água DEPC (In situ DIG marcado Síntese Probe RNA) + um corante de carregamento mL, 5 mL escada de DNA
- Formamida Prehybridization solução de 50%, SSC 5X, 9.2mm ácido cítrico, 1% Tween-20
- Solução de hibridização solução prehybridization-plus 500 mcg / mL tRNA e 50 mcg / mL de heparina
- MAB-100mM ácido maleico, 150mm NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% Tween-20, pH para 7,5
- Bloqueando-Solução 3 partes MAB, 1 parte de 10% de reagente Boehringer bloqueio no MAB, uma parte do calor desativado cordeiro soro
- AP-buffer 60mm pH Tris-HCl a 9,5, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0,1% Tween-20
- Solução-5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato de coloração (BCIP) e Nitro blue tetrazolium (NBT) em tampão AP
4. RESULTADOS REPRESENTANTE
Quando realizada corretamente, a reação entre o NBT, BCIP, e fosfatase alcalina formará um precipitado roxo que deve aparecer no embrião do zebrafish como uma mancha roxa. Riboprobes deve ser previamente sintetizado a partir do cDNA correspondente ao gene de interesse. Portanto, pode-se concluir qualquer visualizadas mancha representa áreas do paulistinha em que o gene de interesse foi transcrita nessa fase especial de desenvolvimento. Para os fins deste curso, riboprobes foram sintetizados a partir aldh1a2 (anteriormente raldh2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates et al, 2005.); myod1 (Weinberg et al, 1996.); shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) e myl7 (anteriormente cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Coloração era esperado na linha média e em estruturas anatômicas, incluindo os somitos, tailbud, myotome, cérebro e coração. Mutantes Ace/fgf8a Esperava-se que têm defeitos em muitas destas estruturas. Coloração foi facilmente visualizado através de um microscópio padrão de dissecação. Fontes adicionais contêm mais informações e solução de problemas em WISH técnicas semelhantes às descritas aqui (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009).
Figura 1. Um embrião zebrafish 24 horas após a fecundação, que tem sido hibridizado com riboprobes específicas para aldh1a2. Coloração específica pode ser visto nos olhos, cérebro posterior, peitoral fin bud primórdios, e somitos. Anterior é para o topo, é posterior ao fundo.
Figura 2. Um embrião zebrafish na fase somito 13 de desenvolvimento que tem sido hibridizado com uma sonda específica para fgf8a. Coloração específica é visto no telencéfalo, diencéfalo dorsal, mesencéfalo rombencéfalo-limite, somitos, e tailbud. Ventral é para a esquerda, dorsal é para a direita.
Figura 3. A 22 horas após a fecundação do embrião zebrafish que foi hibridizada com uma específica para riboprobe pax2a, um marcador robusto útil para visualizar o sistema nervoso. Coloração específica pode ser visto na fissura coróide, mesencéfalo rombencéfalo-limite, vesícula ótica, e os neurônios da medula espinhal. Vista dorsal, com anterior para a esquerda.
Discussão
WISH foi usado em um comparativo curso de laboratório de Vertebrados Biologia para ajudar os alunos a compreender o papel da genética no desenvolvimento anatômico através da visualização dos padrões de expressão gênica conhecida. Para a primeira parte do curso, os alunos realizadas dissecções em organismos representando taxa chordate várias diferentes, permitindo-lhes tempo suficiente para estudar, compreender, comparar e anatomia de vertebrados contraste.
Como uma introdução à segunda parte do curso, os alunos receberam uma palestra formal descrevendo o desenvolvimento zebrafish e anatomia. Os métodos e resultados esperados da experiência WISH também foram discutidas. Os alunos foram então dadas ao vivo em zebrafish somitogenesis e prim-6 estágios de desenvolvimento, e em 2 e 5 dias após a fertilização (DPF) para examinar sob o microscópio de dissecação. Isso era para dar aos alunos uma melhor compreensão do que embriões zebrafish aparência e os tipos de alterações morfológicas que ocorrem durante a ontogenia.
Na sessão de laboratório próximo, os alunos receberam embriões zebrafish em que gostaria que tivesse sido previamente realizada. Eles foram convidados a estudar e descrever os padrões de expressão gênica para cada gene de interesse (riboprobe utilizado). Embriões utilizados para WISH foram derivadas de acasalamentos entre os membros de uma linha ace/fgf8a heterozigotos. Com base na herança mendeliana, 25% dos embriões dos acasalamentos ace/fgf8a deveriam ser mutantes homozigotos e exibir defeitos de muitas das estruturas anatômicas focada em neste curso. Com base em relatórios publicados e não publicados observações no laboratório Albertson, defeitos no cérebro e coração looping imprópria eram esperados, bem como defeitos na somitos (Brand et al, 1996;. Albertson e Yelick, 2005; observações pessoais).
Os alunos foram convidados a examinar todas as amostras, de tipo selvagem (animais heterozigotos são indistinguíveis dos irmãos do tipo selvagem nos estágios iniciais de desenvolvimento) e os mutantes homozigotos, para cada padrão de expressão gênica apresentada. Eles foram, então, convidado a escrever relatórios de laboratório descrevendo seus resultados, e com base em seus conhecimentos de anatomia e genética, como a expressão do gene defeituoso pode ter precipitado malformações anatômicas.
Alunos pareciam receber este exercício de laboratório com entusiasmo e curiosidade. A maioria nunca tinha usado antes e WISH estavam extremamente interessados nesta parte do curso. Alunos encontraram os diferentes padrões de expressão gênica em embriões do zebrafish intrigante, alguns até mesmo descrito o padrão de coloração visualizado por associá-las com o bem conhecido desenhos e símbolos, como um rosto sorridente. Os relatórios de laboratório resultantes mostraram que os alunos tinham um entendimento geral do protocolo WISH ea expressão de genes específicos em estruturas anatômicas. Os estudantes também foram obrigados a entender as funções específicas dos genes estudados utilizando WISH durante o (Stickney et al, 2000 laboratório;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente no entanto, que alguns alunos tiveram conhecimento de fundo limitado das vias de sinalização e genes de interesse. Mais informações sobre esses conceitos no WISH aula introdutória pode ser uma adição bem-vinda ao uso de WISH, no futuro, cursos de Biologia Comparada de Vertebrados.
Desde o protocolo geralmente leva quatro dias consecutivos, dependendo do horário do curso, os alunos só poderão ser capaz de completar uma parte da experiência em sala de aula eo professor deve ser responsável pelo restante. Em nossa classe da Biologia Comparada de Vertebrados, os alunos completaram a coloração reações em laboratório, enquanto o Assistente de Ensino realizou todas as etapas anteriores. Se é preferível que os alunos realizam WISH em sala de aula, o protocolo pode ser dividida em subunidades que podem ser realizadas em sessões de laboratório vários, dependendo do tempo da classe. Se não é viável para os alunos a realizar todo o protocolo, como foi aqui devido à reunião de laboratório apenas uma vez por semana, os alunos podem adicionar a solução de coloração no início da classe e, dependendo do riboprobe usado, tem a coloração completa dentro de uma hora. O tempo que leva para a mancha de desenvolver varia muito com cada riboprobe e uma variedade de condições experimentais, e deve ser determinado antes da aula. Nomeadamente, se os alunos só será desenvolver a mancha no laboratório, os instrutores serão responsáveis por todas as etapas anteriores, o que exigirá tempo e esforços significativos fora da sala de aula. Se desejar, uma alternativa mais curta a WISH poderia ser imuno-histoquímica, utilizando rótulos de anticorpos para visualizar localização de proteínas, no entanto, neste momento, zebrafish anticorpos específicos para os genes de desenvolvimento não estão prontamente disponíveis. Outra opção seria realizar WISH em diferentes espécies de vertebrados umand que os alunos comparar os padrões de expressão dos mesmos genes em diferentes organismos (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. organismos modelo Emergentes, 2008; Organismos modelo emergente, 2010).
O objetivo maior do uso de WISH em um curso de Biologia Comparada de Vertebrados foi demonstrar aos alunos como técnicas da biologia molecular são utilizados para estudar o desenvolvimento anatômico. Ele também proporcionou uma oportunidade para os alunos a especular sobre a forma como alterou a expressão do gene pode conduzir não só a malformações do desenvolvimento, mas também à mudança evolutiva. Formalizado como biologia evolutiva do desenvolvimento (muitas vezes referida como "evo-devo"), este campo de rápido crescimento de estudo pretende ligar o genótipo eo fenótipo através do desenvolvimento, e para elucidar bases mecanicistas potencial de mudança evolutiva. Com a ascensão deste campo, os ecologistas mais, os biólogos do organismo, e fisiologistas estão empregando técnicas moleculares em suas pesquisas. Defendemos que o uso de WISH em um curso de Biologia Comparada de Vertebrados ajudará a manter o currículo atualizado com atuais avanços tecnológicos e conceituais na pesquisa, e para facilitar um melhor alinhamento horizontal dos cursos de biologia de nível superior, combinando subcampos biológica. Além disso, esta abordagem integrativa irá proporcionar aos alunos a oportunidade de aprender uma variedade de técnicas de pesquisa biológica em um curso, levando a uma educação mais diversificada e a promoção da investigação interdisciplinar futuro científico.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o Departamento de Biologia da Universidade de Syracuse e Marilyn Dr. Kerr por seus papéis na administração do curso de Biologia Comparada de Vertebrados. O laboratório Albertson é apoiada por conceder R21DE019223 dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial, bem como conceder R01AG031922 do National Institutes of Health / National Institute on Aging.
Materiais
- Autoclave
- Micro-centrífuga
- 37 ° C incubadora (com agitador)
- 4 ° C micro-centrífuga
- Banho de água
- Vórtice
- Aparelho de eletroforese em gel
- -20 ° C freezer
- -80 ° C freezer
- Rocker / shaker
- 4 ° C geladeira
- Microscópio de dissecação (de preferência com uma tela de ensino ou da câmera)
Referências
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Reimpressões e permissões
