Como nichos e células-tronco se formam durante o desenvolvimento é uma questão importante com implicações práticas. No Drosophila Ovário, células-tronco germinativas e somáticas nichos sua forma durante o desenvolvimento larval. Este vídeo demonstra como dissecar, mancha e montar gônadas femininas do final de terceiro ínstar (LL3) Drosophila.
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Artigo de método
Dissecção e coloração de Drosophila Larval Ovários
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitos órgãos depende de células-tronco para o seu desenvolvimento durante a embriogênese e para a manutenção ou reparação durante a vida adulta. Compreensão de como as células-tronco forma, e como eles interagem com seu ambiente é crucial para a compreensão da homeostase, desenvolvimento e doença. O ovário da mosca da fruta Drosophila melanogaster tem servido como um modelo influente para a interação de células-tronco germinativas (GSCS) com suas células somáticas de apoio (nicho) 1, 2. O local conhecido do nicho e as GSCS, aliada à capacidade de manipular geneticamente eles, tem permitido aos pesquisadores elucidar uma série de interações entre células-tronco e seus nichos 3-12.
Apesar da riqueza de informações sobre mecanismos de controle de manutenção GSC e diferenciação, relativamente pouco se sabe sobre como GSCS e seus nichos de forma somática durante o desenvolvimento. Cerca de 18 nichos somáticas, cujos componentes incluem celulares filamento terminal e as células da tampa (Figura 1), formam-se durante o terceiro instar larval 13-17. GSCS originam de células germinativas primordiais (PGCs). PGCs proliferam no início fases de larva, mas após a formação do nicho um subgrupo de PGCs torna-se GSCS 7, 16, 18, 19. Juntas, as células somáticas e de nicho a GSCS fazer uma unidade funcional que produz ovos durante toda a vida do organismo.
Muitas perguntas sobre a formação da unidade GSC permanecem sem resposta. Processos tais como a coordenação entre as células precursoras de nichos e de precursores de células-tronco, ou a geração de assimetria dentro PGCs como eles se tornam GSCS, pode ser melhor estudados na larva. No entanto, um estudo metódico do desenvolvimento larval ovário é fisicamente desafiador. Primeira, os ovários das larvas são pequenas. Mesmo em final de estágios larvais são apenas 100μm de diâmetro. Além disso, os ovários são transparentes e estão embutidos em um corpo de gordura branca. Aqui nós descrevemos um protocolo passo a passo para isolar ovários de final do terceiro instar as larvas Drosophila (LL3), seguido por coloração com anticorpos fluorescentes. Nós oferecemos algumas soluções técnicas para problemas como a localização dos ovários, coloração e lavagem de tecidos que não afundam, e certificando-se que os anticorpos penetrar no tecido. Este protocolo pode ser aplicado a fases anteriores larval e testículos larval também.
Protocolo
1. Postura de ovos
- Cinco dias antes da dissecação: permitir que as fêmeas põem ovos acoplado a por 2-4 horas em alimentos frescos suplementados com levedura. Para obter larvas sincronizados e bem desenvolvidas, é importante não ter superlotadas cultivadas (cerca de 30 ovos / frasco 25mm). Tipicamente, 7-16 fêmeas são usados por frasco, dependendo de quão bem eles estabelecem.
2. Seleção de larvas
- Prepare um prato de vidro de 9 dissecar bem cheio com meio de Ringer (NaCl 128mm, 2mM KCl, CaCl 2 1,8 mm, 4mm MgCl 2, 35.5mM sacarose, pH Hepes 5mM 6.9).
- Prepare filtros célula em uma ....
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Discussão
Este vídeo demonstra um isolamento e protocolo de coloração da final do terceiro instar larval ovários. Para executar este protocolo rotineiramente e de forma confiável, a atenção deve ser dada aos seguintes pontos:
- Para as larvas sincronizados e bem desenvolvida, a superlotação deve ser evitada.
- Para evitar a perda dos ovários pequenos translúcido, certifique-se de dissecar a gordura corporal intacta. Isso também irá ajudar a localizar os ovários na fase de montagem, particularmente quando de mon.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
IM é apoiado pela Marie Curie conceder re-integração. Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Ciência Israel não Grant. 1146-1108, pelo e Helen Kimmel Martin Institute for Stem Cell Research no Instituto Weizmann de Ciência ea Fundação Charitable Leir.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sacarose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumina Bovina Fração V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Pincetas biológicas Dumont 5 dumstar polidas | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Suporte para pinos niquelado | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pinças minutien de aço inoxidável, diâmetro 0,1 mm, comprimento 10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Placas de 9 poços, 85×100 mm, 22 mm de diâmetro externo × 7 mm de profundidade | Corning | 7220-85 | |
| Microsscópio estereoscópico MZ 16.5 com base padrão de luz transmitida TL ST | Leica Microsystems | ||
| Placas de 6 poços | Costar | 3516 | |
| Lâminas | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cobriobjetos | Corning | 2940-223 | |
| Meio de montagem | Vectashield | H-1200 | |
| Filtro celular | Falcon BD | FAL352350 | |
| Anticorpo 1B1 | Banco de Híbridos de Estudos do Desenvolvimento | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratório do Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratório da Dra. Ruth Lehmann | ||
| Anti-β-Galactosidase | Cappel | ||
| Anticorpos Secundários | Jackson ImmunoResearch |
Referências
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21<....
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Reimpressões e permissões
