O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento. In vivo Análise do desenvolvimento de células progenitoras do prosencéfalo neural em um nível clonal pode ser alcançada dessa forma.
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Artigo de método
Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior
Neste artigo
Resumo
Resumo
Padrões precisos de migração, divisão e diferenciação das células progenitoras neurais são cruciais para o desenvolvimento adequado do cérebro e 1,2 função. Para entender o comportamento das células progenitoras neurais no complexo no ambiente vivo, lapso de tempo imagens ao vivo de células progenitoras neurais em um cérebro intacto é extremamente necessário. Neste vídeo, nós explorar as características únicas de embriões zebrafish para visualizar o desenvolvimento de células progenitoras neurais prosencéfalo in vivo. Usamos a eletroporação geneticamente e pouco etiqueta individual células progenitoras neurais. Resumidamente, o DNA construções de codificação para marcadores fluorescentes foram injetados no ventrículo do cérebro anterior de 22 horas após a fertilização (hpf) embriões zebrafish e pulsos elétricos foram entregues imediatamente. Seis horas depois, os embriões do zebrafish electroporated foram montadas com baixo ponto de fusão de agarose em placas de cultura de vidro de fundo. Fluorescente etiquetado células progenitoras neurais foram então fotografada por 36 horas com intervalos fixos sob um microscópio confocal utilizando água lente objetiva de imersão. O presente método fornece uma maneira de obter insights sobre o desenvolvimento in vivo de células progenitoras neurais do cérebro anterior e pode ser aplicado a outras partes do sistema nervoso central do embrião zebrafish.
Protocolo
1. Preparação de Embriões Zebrafish
- Dois dias antes da eletroporação, criada gaiolas de acasalamento de peixes do tipo selvagem usando divisores para os machos separados das fêmeas.
- Um dia antes da eletroporação, puxe os divisores em gaiolas de acasalamento do dia anterior.
- Coletar embriões e incubar 50 embriões fertilizados em 30 ml de meio embrionárias contendo phenylthiourea 0,003% (PTU) a 28,5 ° C.
- No dia da eletroporação, dechorionate os embriões manualmente com uma pinça fina (Inox 5, Dumont Eletrônico, Suíça), quando os embriões atingem o estágio de desenvolvimento de 22hpf. Em seguida, transferir os embriões para ....
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Discussão
Neste vídeo, demonstramos um método para time-lapse imagens ao vivo de células progenitoras neurais em um nível clonal no prosencéfalo zebrafish em desenvolvimento. Nós testamos e modificou o eletroporação protocolos existentes para 4-6 geneticamente e fluorescente etiqueta individual células progenitoras neurais. Uma árvore de linhagem clonal composto de células descendentes relacionados pode ser estabelecida uma vez que apenas algumas células eram escassamente rotulados com uma tensão relativamente baixa de.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela theNIH grantNS042626. Agradecemos a Kurt Thorn e UCSF Nikon Imaging centro de assistência com a imagem.
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Referências
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- G#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).
- Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V.
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Reimpressões e permissões
