Medindo Coordenação Motora em Ratos

Resumo

Protocolos são apresentados para duas tarefas estabelecidas coordenação motora, o bar rotarod e horizontal, acelerando também dois testes desenvolvidos em Oxford recentemente, as hastes estáticos e barras paralelas. Estes testes podem detectar deficiências motoras potencialmente de interesse em seu próprio direito, bem como possíveis variáveis ​​em testes de outras áreas do comportamento.

Resumo

Ratos são cada vez mais usados ​​em neurociência comportamental, em grande parte substituindo os ratos como animais de escolha do behaviorista. Antes de aspectos do comportamento, tais como emotividade ou a cognição pode ser avaliada, no entanto, é vital para determinar se as capacidades motoras de por exemplo, um rato mutante ou lesionado permitir que essa avaliação. Desempenho na tarefa do labirinto de uma necessidade de força e de coordenação, tal como o labirinto de água de Morris, bem poderia ser prejudicada em um rato pelo motor, em vez de cognitiva, deficiências, de modo que é essencial para dissecar selectivamente o último a partir da primeira. Por exemplo, sensório prejuízos causados ​​por antagonistas de NMDA tenham sido mostrados para prejudicar o desempenho do labirinto de água ^2.

Coordenação motora tem sido tradicionalmente avaliada em ratinhos e ratos pelo teste de rotarod, na qual o animal é colocado sobre uma haste horizontal que gira em torno do seu eixo longitudinal, o animal andar para a frente para permanecer na posição vertical e não cair.Tanto a velocidade definida e versões de aceleração do rotarod estão disponíveis.

Os outros três testes descritos neste artigo (barra horizontal, barras estáticas e barras paralelas) toda a coordenação medida em aparelho estático. A barra horizontal também exige força para o desempenho adequado, principalmente dos membros anteriores como o rato, inicialmente, apertos do bar apenas com as patas dianteiras.

Ratos adultos não têm bom desempenho em testes, como as hastes estáticos e barras paralelas (observações pessoais), eles parecem menos bem coordenadas do que os ratos. Eu testei apenas ratos machos, no entanto, e camundongos machos parecem geralmente menos bem coordenado que as fêmeas. Ratos parecem ter uma maior força: a relação peso do que os ratos, o nome em latim, Mus musculus, parece inteiramente apropriado. O rotarod, as variações do teste de falha ¹² ou a pé (Noldus) ¹⁵ passarela aparelhos são geralmente usados ​​para avaliar a coordenação motora no rato.

Introdução

Comportamento se manifesta pela ação, e ação requer habilidades motoras, incluindo a coordenação do corpo. Uma das primeiras experiências na história do comportamento animal foi realizado por Colin Stewart, uma estudante de doutorado na Universidade Clark, em os EUA ^11. Ele mediu a atividade de ratos, colocando-os em um tambor e contou o número de vezes que ele se transformou. Este aparelho precoce era provavelmente o precursor de rodas de correr e o teste rotarod actualmente utilizados, embora o aparelho em Stewart foi o rato dentro do cilindro, o movimento do qual foi conduzido pelo de rato, enquanto que no rotarod o animal anda sobre o exterior um cilindro ou haste rotativa que é motorizado.

A haste original usado por Dunham e Miya (1957) ⁷ tinha uma velocidade set, mas as versões atualmente acelerada (Jones e Roberts 1968) ⁹ estão disponíveis. A desvantagem de um rotarod velocidade definida é que alguns animais com má coordenação vai cair emo início, enquanto que para aqueles que não ficar, o teste vai em breve começar a medir a resistência em vez de coordenação per se. A distribuição bimodal resultante de pontos de dados pode ser suficientemente anormal de modo a impedir a análise paramétrica. Quando um rotarod aceleração for utilizado, particularmente se ela é acelerado apenas quando um critério conjunto, como ficar por 10 segundos, é alcançada, a distribuição de dados é mais provável que seja de Gauss. A taxa de aceleração pode ser ajustada de modo que a fadiga do motor não desempenha um papel significativo no rendimento, um rato é improvável que seja marcadamente desgastado depois de apenas 2-3 min tempo no rotarod.

O "test string" ¹ ", teste cabide" ou na barra horizontal mede a força e coordenação dos membros anteriores. Os dois epítetos citados referem-se ao seu desenvolvimento, originalmente foi utilizada uma corda, mas os autores observaram que o desempenho depende muito de como a corda foi esticada, portanto, futuros pesquisadores usaram uma barra de metal, muitas vezes, um cabide. Descobrimos que a capacidade de um rato para segurar a barra é inversamente proporcional ao seu diâmetro, e foram usados ​​de forma padrão bar de 2 mm. No teste de pesos (ver protocolo JOVE "Medição da resistência de ratinhos"), o fio muito fino de uma pele / escala chaleira colector permite que os animais mais fortes para garantir uma boa aderência tal que possam levantar mais do que o seu próprio peso corporal. No entanto, utilizando-se barras horizontais de diâmetro maior pode ser uma vantagem que a sensibilidade do ensaio de melhora, com apenas uma barra de 2 mm de ratinhos C57BL / 6 normais mais alcançar desempenho tecto. Daí que adoptaram recentemente um aparelho de três barras, as barras podem ser facilmente trocados como eles se encaixam em fendas cortadas em topos das colunas de sustentação. As barras são mantidas sob tensão (especialmente importante para fazer a barra de dois milímetros rígida), pois só cabem os entalhes quando os suportes são ligeiramente desenhadas em conjunto (como um arco e sua seqüência) (ver Figura 3).

Hastes estáticos ou vigas têm sido muitas vezes usadopara medir a coordenação, mas motivação adicional sempre foi usado para convencer os animais a atravessar a haste. Eles negociaram uma viga horizontal para alcançar um objetivo desejado, como a gaiola, refúgio de uma luz brilhante, ou o alimento (se é que tem sido feito com fome). No entanto, no decurso da investigação neste tipo de teste, descobri que os ratos se virar-se espontaneamente quando colocado na posição "aberto" extremidade de uma barra em cantilever e, em seguida, atravessando-o até que se chegou ao final suportado. Esta técnica elimina a necessidade de formação (necessário nas variantes de ensaio mencionados anteriormente) que a reacção inata de um rato, para ser colocada perto da extremidade de uma haste de elevação é a tentativa de alcançar a extremidade suportada. Isso não significa, é claro, eliminar o problema de que as mudanças de motivação pode afetar o desempenho, o que é sempre uma possibilidade com este tipo de procedimento.

Túneis de papelão são atualmente muito utilizado para casa gaiola enriquecimento ambiental, mas sua desvantagensvista no contexto atual é que os animais vão inevitavelmente ser praticado em equilíbrio em cilindros que podem tombar sobre o seu eixo longitudinal, imitando as habilidades necessárias para o equilíbrio do rotarod. Assim casa gaiola enriquecimento poderia mascarar um fenótipo comportamental, um exemplo é a melhoria do fenótipo da doença de Huntington por um enriquecimento de ^14. Animais também muitas vezes a pé ao longo do eixo destes túneis, como ao caminhar ao longo de uma viga de estática elevada. Portanto, eu construí um par de elevados barras paralelas, e colocou os ratos no meio com as patas dianteiras sobre um bar e as patas traseiras por outro lado, uma situação que nunca teria encontrado antes. Ratos teve de chegar ao fim de suportar as barras paralelas, enquanto permanece em posição vertical para passar no teste. Um dispositivo um pouco semelhante foi uma série de barras paralelas colocadas em uma gaiola mouse para avaliar o desenvolvimento do tremor induzido por disfunção motora ^13.

Nós já testado várias centenascamundongos para o funcionamento do motor em Oxford. Estes recebeu vários tratamentos, incluindo agentes farmacológicos, ou a transferência passiva de tecido (o plasma) de seres humanos, mas principalmente animais geneticamente modificados. Alguns animais foram mais prejudicados em força do que as tarefas de coordenação, outros vice-versa. Alguns ratos foram mais comprometida em que o rotarod em substratos estáticas, tais como as hastes fixas e barras paralelas, outros vice-versa. Assim, o presente artigo e do protocolo JOVE acompanhamento "Medição de força em ratos") descrevem como caracterizar a forma como diferentes tratamentos e mutações podem afetar diferencialmente a função motora em ratos. Além do rotarod o aparelho descrito aqui é simples, barato e particularmente adequado para os laboratórios não especializados para testar habilidades motoras. Para análise da marcha em escala fina, o sistema Catwalk é um sistema muito mais sofisticado do que os métodos mais antigos, como convencer um rato para percorrer um banho de tinta e, em seguida, por um pedaço de papel, mas é uma expensive elementos de aparelhos.

Todos esses testes são projetados para medir a coordenação ao invés de força, embora, obviamente, um grau mínimo de tônus ​​muscular é necessário simplesmente para o mouse para usar seus membros. Para avaliação da força, o procedimento de ecrã invertido ¹⁰ é mais apropriada, ou, se uma medição mais gradual for necessário, o teste de pesos ou a sua barra automatizada-pull equivalente (descrito no protocolo JOVE "Medição da força em ratinhos"). A exceção é o teste da barra horizontal, que exige tanto força e coordenação para o desempenho bem sucedido.

Protocolo

1. Aparelho

Para todos os testes, uma superfície acolchoada macio é colocado na base do aparelho, para amortecer quaisquer murganhos que caem. NB Isto não é mostrado nas figuras, de modo a não obscurecer a qualquer parte do aparelho. Durante o teste de centenas de murganhos, tanto normais e mutante, que nunca observado qualquer dano causado pela queda de tais aparelhos, que é tipicamente 30-50 cm de altura. Além disso, certifique-se de limpar e esterilizar o equipamento entre cada rato testado.

1.1 Rotarod

Existem diversas versões comerciais deste aparelho no mercado, mas têm alguns inconvenientes, tais como a não acelerar a uma velocidade adequada para a detecção de incoordenação motora (em vez de resistência). Outra falha comum é que a haste não é suficientemente elevada acima da base, o que resulta em ratinhos que tendem a deixar cair ou saltar.

O rotarod mostrado na Figura 1, foi introduzida na concepçãodo autor pelos setores de engenharia do Departamento de Farmacologia da Universidade de Oxford. A haste é de 3 cm de diâmetro, suportados 30 cm acima da base do aparelho. A superfície é serrilhado em uma série de sulcos paralelos ao longo do eixo longitudinal, permitindo que os ratinhos a prender eficazmente (Figura 2). NB A profundidade dos sulcos é um detalhe vital, se o mouse não pode obter uma boa aderência, o teste será muito mais difícil, por outro lado, se a aderência é muito bom o mouse vai "cambalhota" em torno da haste passivamente segurando sobre a mesma. "Para os fabricantes de rotarod amadores", pode ser útil saber que cavilhar madeira serrilhado de um tamanho adequado para ratos está disponível comercialmente, mas, evidentemente, precisa ser tratada com um bom verniz à prova d'água antes do uso. A velocidade inicial é ajustado para 4 rpm, a taxa de aceleração de 20 rpm / min. A velocidade máxima é de 40 rpm.

Duas flanges impedir o rato sair da haste. Eles são de 30 cm de diâmetro (istoprovavelmente poderia ser reduzido para 20 cm). A separação é fixado em 6 cm (máximo), mas podem ter de ser ajustada para o menor sub-ratinhos adultos quando eles tendem a girar em torno da haste.

1,2 barras horizontais triplos (Figura 3)

As barras são feitas de latão, de 38 cm de comprimento, realizada 49 centímetros acima da superfície da bancada por uma coluna de sustentação de madeira em cada extremidade. As colunas são fixados a uma base de madeira pesada. Três diâmetros de barras estão disponíveis: 2, 4 e 6 mm. O bar de 2 mm é o padrão que usamos, mas muitos ratos atingir pontuação máxima sobre isso. Portanto barras de maior diâmetro têm sido incluídos em uma tentativa para refinar o teste, enquanto os ratos não podem agarrar estas tão bem.

1.3 hastes estáticos

Cinco buchas de madeira ou perfis, de espessura variável (35 (haste 1), 28, 22, 15 e 9 (haste 5) mm de diâmetro) com 60 cm de comprimento são fixadas por uma G-braçadeira para uma prateleira de laboratório de tal modo que as hastes salientes horizontalmente para o espaço (Figura 4). A extremidadeda haste perto do banco tem uma marca de 10 cm da extremidade, para denotar a linha de chegada. A altura das hastes acima do chão é de 60 cm.

Se for necessário um teste mais curtos e menos detalhada, utilize apenas os maiores e hastes menores e meio. Van Dellen et al. ¹⁴ utilizado apenas uma única haste de avaliar o progresso da doença de Huntington em ratinhos.

1.4 Barras paralelas

Duas barras de aço paralelos 1 m de comprimento e 4 mm de diâmetro, são fixados de 30 mm (em seus centros) separados por colunas de apoio em madeira em suas extremidades (Figura 5). As barras são de 60 cm acima do chão.

2. Procedimento

Para todos os testes, camundongos trazer para a sala experimental 5-20 min antes do teste, para garantir que eles são totalmente acordado. Como regra geral, para permitir a recuperação da força muscular e um retorno aos níveis normais de excitação, descansar os ratos por um retorno à jaula para casa depois de cada teste motor.

2.1 Rotarod

Definir o rotarod com uma velocidade inicial de 4 rpm, taxa de aceleração de 20 rpm / min. Segurando o rato pela cauda, ​​e colocá-lo na haste rotativa, de costas para o sentido de rotação por isso tem de andar para a frente para ficar em pé. Isto é mais fácil de fazer se o rato é trazido para cima para a haste segundo um ângulo de 45 ° abaixo da horizontal, a tentativa de diminuir o rato a partir de cima vai resultar em que espalha suas pernas traseiras e agarrar as extremidades dos flanges. Solte rapidamente o mouse quando ele está quase tocando a barra, apenas à frente e acima das barras de ponto morto superior, o que lhe permite agarrar facilmente a haste. Uma técnica (provavelmente mais fácil e mais fiável) é a utilização de um (10-15 mm) passador fino. Segurando o mouse em uma mão, baixe-o para o passador, em paralelo ao longo eixo. A cavilha é inclinada para baixo, com a cabeça de rato cerca de 30 ° para dar mais tempo para agarrar o rotarod, uma vez que é libertado. Abaixe o mouse e passador entre the flanges do rotarod, e uma vez sobre a haste rotativa a puxar o pino para baixo, longe do mouse, que irá captar a vara e andar para a frente.

Aos 10 segundos depois de colocar o mouse sobre a barra, começar a aceleração (desde que o mouse é voltado para a frente, se não, espere até que ele faz para a frente antes de começar a aceleração), e observe a velocidade com que o mouse cai. Se ele cai antes de 10 segundos, observe o tempo de queda e tente novamente, até três vezes no total, registrando a velocidade com a primeira queda após o ponto 10 seg. No entanto, cai antes de 5 segundos que são devido à má colocação pelo experimentador não devem ser registrados. A velocidade média de queda é o dado, em vez de usar a velocidade máxima, isso corrige para a prática extra, o rato recebe durante as corridas fracassado, que é assumido ajudaria performance. Assim, um rato que cai antes de 10 segundos, em seguida, uma vez que permanece em até 12 rpm segundo contagens de tempo (4 +12) / 2 = 8 rpm. Um rato cair duas vezes, em seguida,permanecer por 10 rpm pontuação (4 +4 +10) / 3 = 6 rpm. Se um rato não pega em 10 segundos, três vezes atribuir uma pontuação de 4 rpm.

Um problema é que os ratos às vezes parar de andar para a frente e segurar a vara com firmeza em vez disso, para que eles passivamente cambalhota rodada, embora a maioria, eventualmente, cair. Portanto, pode ser útil observar também a velocidade quando ocorre o primeiro tal inversão. Uma solução possível pode ser a utilização de uma haste com um diâmetro maior ou sulcos menos pronunciados.

2.2 As barras horizontais

Como ratos encontrá-lo mais fácil de entender o estreito mm bar 2, é recomendável testá-los em primeiro lugar em um presente. Segurando o rato pela cauda, ​​colocá-lo no banco na frente do aparelho, deslize-o rapidamente para trás cerca de 20 cm (este alinha-perpendiculares ao bar), levante-se rapidamente e deixá-lo agarrar a barra horizontal no ponto central, com as patas dianteiras somente, e solte a cauda, ​​ao mesmo tempo iniciar o stopclock. Este cum ser difícil de alcançar de forma eficiente; alguma aderência camundongos melhor se a cauda é liberada de repente, se eles sentem que ainda são suportadas eles podem deixar de aderência. O ponto de critério é ou uma queda da barra antes de o rato atinge uma das colunas de extremidade da barra, ou o tempo até uma pata toca uma coluna. O tempo máximo de prova (tempo de corte) é de 30 segundos.

Se o mouse não consegue alcançar a barra corretamente primeira vez e este parece ser atribuível a técnica do experimentador, ao invés do mouse, tente novamente (depois de um breve descanso, enquanto mais um ou dois ratos são testados) e não gravar esta queda. Se o rato cai antes de 5 segundos e isso não é, aparentemente, devido à má colocação pelo experimentador, repita até três vezes, na tentativa de obter a> 5 seg pontuação. Se> 5 seg na segunda tentativa, não fazer um terceiro ensaio. Tome a melhor pontuação como referência. Um rato que falha repetidamente para se sustentar durante> 5 seg pontuação apenas um.

Se a versão tripla barra está a ser utilizado, se o rato pontuações 5 mm nesta primeira barra 2 que pode então ser testada em barras grossas, após um breve período de repouso durante mais um ou dois ratinhos são testados. O sistema de pontuação para as barras 4 e 6 mm é o mesmo que para a barra 2 mm, o resultado final é o total acumulado. Assim, um rato que a pontuação 5 na barra de 2 milímetros, mas cai do bar 4 mm após 13 pontos seg 5 +3 = 8.

2.2.1

Marcar as barras horizontais: os primeiros dois intervalos são menos do que a última, uma vez de dois como os ratinhos foram inicialmente domina a tarefa que têm menos probabilidade de cair:
Caindo entre 1-5 sec = 1
Caindo entre 6-10 seg = 2
Caindo entre 11-20 seg = 3
Caindo entre 21-30 seg = 4
Caindo depois de 30 segundos = 5
Colocar uma pata em um bar de apoio, sem cair = 5

NB como o uso opcional de 4 e 6 milímetros bares é uma nova adição ao nosso protocolo que ainda não têm uma vastaexperiência com eles.

2.3 hastes estáticos

Posicione o mouse na extremidade da maior haste (comprimento do nariz ponta a cabeça a partir do final é o ideal). Tomar duas medidas: tempo de orientação (tempo necessário para orientar a 180 ° a partir da posição inicial para a prateleira) e do tempo de trânsito (o tempo necessário para percorrer a fim de prateleira (nariz para além da marca cm a partir da extremidade da haste de prateleira 10).

Orientação é dependente do rato ficar na posição vertical, se ele vira de cabeça para baixo e se apega abaixo da haste, atribuí-lo arbitrariamente (para fins estatísticos) a pontuação máxima orientação de 120 seg. Não testá-lo em barras menores, também o tempo de trânsito torna-se o valor máximo como um rato que transita na vertical é, obviamente, melhor coordenação de um que transita enquanto pendurado de cabeça para baixo.

Se, depois de orientar, o rato cai ou atingir o tempo máximo de prova (arbitrariamente fixado em 120 segundos) não testá-lo em shastes maller. Para fins estatísticos, os ratos atribuem queda são atribuídos 120 para aquela vara em particular e para os subsequentes, uma vez que é assumido que voltaria a cair a partir de uma haste estreita. Se o mouse vira de cabeça para baixo, observe também este evento, pois o trânsito de sucesso, bem como a orientação que deve ficar em pé sobre a haste. Caso contrário, atribuir-lhe a pontuação máxima. Remover o rato após atingir a extremidade da haste, ou cataratas.

Depois de testar em uma haste de retornar o mouse para a gaiola para casa para descansar, enquanto você testar outro mouse. Em seguida, colocá-lo na próxima haste tamanho menor e testá-lo, da mesma forma novamente. Pare o teste se o rato cai uma haste depois de estar nele por mais de 5 segundos. Se ele caiu em menos de 5 segundos substituí-lo e permitir que outra tentativa (como cair dentro de 5 segundos pode ser devido a colocação defeituosa pelo experimentador), para um máximo de três ensaios, e usar o melhor resultado.

2.4 Barras paralelas

Posicione o mouse na tele centro das duas barras, com o seu eixo longitudinal perpendicular ao das barras; ambas as patas dianteiras deve ser de um bar, ambas as patas traseiras no outro bar. A pontuação é semelhante ao das barras fixas. Tomar duas medidas: o tempo até o rato orienta 90 ° para a posição de início, e o tempo até que posteriormente atinge um dos suportes terminais. Se o mouse vira de cabeça para baixo, observe também este evento. Como para as hastes de ensaio estáticos, orientação e de trânsito devem ser conseguidas sem ela virado de cabeça para baixo, caso contrário, é atribuído o tempo máximo. É raro para ratos razoavelmente saudáveis ​​a cair em menos de 5 segundos, se isso acontecer provavelmente é devido à má colocação. Portanto descartar o resultado e testar novamente o mouse.

Resultados

Resultados Esperados

Uma haste de estática foi inicialmente utilizado para monitorizar o progresso da doença de Huntington em ratinhos mutantes, com ou sem enriquecimento ambiental nas suas gaiolas ^14. O programa de enriquecimento atrasou significativamente o início da disfunção motora na haste, que foi acompanhada por um atraso no início da pata traseira apertando, um sinal geral de comprometimento neurológico.

Ratinhos infectados com scrapie mostraram uma diminuição no desempenho da barra horizontal a partir da semana 16 pós-injecção, em testes rotarod a partir da semana 18, e as hastes estáticos a partir de pelo menos 19 ⁸ semanas (ensaio anterior, não foi realizada). Subunidade de canais de KATP Kir6.2 KO murganhos deficientes nas hastes estáticos e barra horizontal, mas não na rotarod ^4. As lesões do hipocampo não teve qualquer efeito em qualquer medida da capacidade do motor ^5, mas 129S2/Sv murganhos deficientes em relação à estirpe C57BL / 6 com as hastes de Rotarod e estático ^3. C57BL/10 ratos também tiveram pior desempenho motor de ratinhos C57BL / 6 ^6, embora não no mesmo grau que 129S2/Sv ratinhos.

Figura 1. O rotarod.

Figura 2. Detalhe da haste serrilhada do rotarod.

Figura 3. As barras horizontais triplo do bar realizada nos entalhes é o básico 2 milímetros; uma. Pregado por baixo (apenas para demonstração) são as barras 4 e 6 mm. Na prática, apenas uma barra de cada vez é entalhado com entalhes nos apoios.

Figura 4. Um rato que atravessa a haste estática.

Figura 5. Um rato nas barras paralelas. Padding foi omitido apenas para fins de demonstração.