O modelo de injeção de sangue autólogo de hemorragia intracerebral em camundongos descritos neste protocolo usa a técnica de injecção dupla para minimizar o risco de refluxo de sangue até a faixa de agulha, não anticoagulantes no sistema de bombeamento, e elimina todo o espaço morto e tubos expansíveis no sistema.
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Artigo de método
Injeção de sangue autólogo de Modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A investigação da fisiopatologia da lesão após hemorragia intracerebral (HIC) exige um modelo animal reprodutível. Embora a HIC represente 10-15% de todos os acidentes vasculares cerebrais, ainda não existe uma terapia específica eficaz. O modelo de injeção autóloga de sangue em camundongos envolve a injeção estereotáxica de sangue arterial na região dos gânglios basais, simulando uma hemorragia hipertensiva espontânea no ser humano. A resposta à hemorragia pode então ser estudada in vivo e os déficits neurocomportamentais podem ser quantificados, permitindo a descrição da patologia resultante e a avaliação de agentes terapêuticos potenciais. O procedimento descrito neste protocolo utiliza a técnica de dupla injeção para minimizar o risco de refluxo sanguíneo ao longo do trajeto da agulha, não utiliza anticoagulantes no sistema de bombeamento e elimina todo o espaço morto e tubos expansíveis no sistema.
Protocolo
1. Preparação de equipamentos
- Limpe o quadro estereotáxico e bomba com etanol 75% para minimizar a contaminação bacteriana.
- Esterilizar Hamilton seringa e agulha de sílica fundida.
Nota: Se esterilização química é usado, não se esqueça de lavar várias vezes em água estéril antes do uso. - Limpe a superfície do papel de cera de parafina com etanol 75% e deixar secar.
2. Preparação de mouse para injeção
Nota: Tenha ratos entregues à sua facilidade de animais pelo menos 7 dias antes da cirurgia, que lhes permitam adaptar ao novo ambiente e reduzir o estresse.
- Pesar do mouse para linha de base pré-operatório.
- Induzir a anestesia com oxigênio a 30%, 70% de óxido nitroso e isoflurano até 4% que não respondem a pitada de cauda
- Injetar mouse com buprenorfina por via intraperitoneal 0.1mg/Kg para analgesia pós-operatória
- Raspar couro cabeludo
- Olhos casaco com vaselina estéril
- Prepare couro cabeludo com betadine x 3 wipes, em seguida, permitir couro cabeludo para secar
- Faça um centímetro incisão mediana sagital do couro cabeludo com bisturi cirúrgico estéril
Nota: A incisão generosa irá permitir a exposição completa de marcos crânio. - Shave um centímetro da superfície ventral da cauda com início em 1 cm da base e preparar com betadine x 3 wipes
- Rato lugar no quadro estereotáxico
Nota: É importante assegurar mouse está seguro no quadro com a superfície do crânio paralelo com a base do quadro, com excelente exposição do bregma e pelo menos 3 mm à direita do bregma.
3. Cirurgia hemorragia intracerebral
Notas: Durante toda a cirurgia o mouse é anestesiado com oxigênio a 30%, 70% de óxido nitroso, e 1-3% do isoflurano, foi mantido a 37 ± 0,5 ° C usando um termistor-almofada de aquecimento controlado e monitorado por termômetro retal.
- Anexar estéril 27 g em 1 agulha de seringa cc no frame.
- Ajuste o braço estereotáxico até agulha é exatamente sobre bregma.
- Ajuste o braço de modo que a agulha é 2,5 milímetros lateral ao bregma e inferiores para a superfície do crânio.
- Manualmente girar seringa para fazer orifício de trepanação na superfície do crânio ao aplicar movimento descendente suave do quadro de tomada de cuidado para não perfurar o crânio completamente.
- Remova a agulha e orifício de trepanação completa manualmente com seringa / agulha
Nota: Completando o orifício de trepanação à mão permite o reconhecimento imediato quando tiver perfurado a tabela interna do crânio e minimiza o risco de, inadvertidamente, empurrando agulha no parênquima cerebral. - Fazer incisão transversal na superfície ventral da cauda utilizando lâmina cirúrgica estéril e permitir 2-3 gotas grandes de sangue arterial a cair sobre o papel de cera de parafina. Em seguida, rapidamente parar o sangramento com pressão usando gaze estéril.
- Retirar 17 mL de sangue em seringa e seringa Hamilton lugar na bomba.
- Ajuste o braço estereotáxico para apontar 5 ° medialmente em relação ao eixo vertical.
- Ajustar cuidadosamente o braço estereotáxico de forma que a ponta da agulha está sobre o orifício de trepanação no crânio e abaixe agulha de 3,5 mm.
- Aguarde 2 minutos, em seguida retire a agulha 0,5 mm (de modo que a ponta é de 3 mm de profundidade)
- Espere 5 minutos para permitir que o cérebro re-expansão ao redor da agulha e minimizar o risco de refluxo de sangue até a faixa de inserção da agulha durante a injeção.
- Injetar mL de sangue 1 / minuto para 7,5 mL.
- Espere 5 minutos para permitir que o sangue inicial de coagulação e de mudanças do tecido ocorrer para minimizar a elevação da pressão intracraniana.
- Injetar a 7,5 mL restantes de 1 mL / minuto
- Permitir agulha para permanecer no local por 25 minutos para permitir a coagulação do sangue
Nota: Não esperar até que a coagulação do sangue irá resultar em refluxo de sangue até o local de inserção de agulha para retirar a agulha - Lentamente, retirar a agulha e lave imediatamente com água quente para evitar qualquer sangue residual na agulha de coagulação e garantir a reutilização da agulha.
- Remova o mouse a partir do quadro e fechar o rabo e incisões no couro cabeludo com cola cirúrgica veterinária.
- Desligue a anestesia.
- Permitem mouse para despertar ao ser aquecido continuamente com acesso gratuito à umedecido alimentos.
- Retorno do mouse para gaiola com littermates quando totalmente acordado. Lugar úmido alimentos pelota no fundo da gaiola para ajudar os animais no acesso aos alimentos.
4. Resultados representativos:
Figura 1. Secção coronal do cérebro do rato 15 minutos após a cirurgia ICH. Imediatamente após o sacrifício do cérebro foi inspecionado por ICH sucesso com base na inspeção bruta de uma seção coronal no local de inserção da agulha. Hemorragias que rastreou até a base do cérebro, a pista agulha após o corpo caloso, ou para os ventrículos foram consideradas mal sucedidas e que o mouse foi eliminado de todas as análises. Geral ICH succetaxas ss foram 75-85%, em 50 ratos com mortalidade de 0%.
Figura 2. Testar Cilindro demonstra hemiparesia esquerda após ICH gânglios basais direito. (A) traseira do mouse Amostra após a cirurgia ICH. Observe a colocação de apenas forelimb o direito sobre a parede do cilindro após ICH gânglios basais esquerdo. (B) Gráfico de testes cilindro 1 resultados da coorte de camundongos após ICH cirurgia (n = 5) em comparação com placebo (n = 4). Ratos Sham tiveram todos os procedimentos, exceto a injeção de sangue (agulha foi inserida no cérebro). Cada rato foi colocado em uma de 12 cm de diâmetro do cilindro de vidro claro e observado por 20 partes traseiras. A colocação inicial dos membros anteriores na parede do cilindro foi marcado por de trás. Movimentos posteriores (como a exploração lateral) não foram marcados até o rato voltou para o solo ea parte traseira próxima marcado. O índice foi calculado como a lateralidade (direita # colocações forelimb no lado do cilindro - # deixou colocações forelimb) / (# # direito + esquerdo + # ambos), onde 0 indica nenhuma preferência forelimb e 1 indicado apenas forelimb o direito foi usado .
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Discussão
Este modelo cirúrgico da hemorragia intracerebral em camundongos, utilizando a cauda resultados autólogo de sangue arterial em um modelo reprodutível de hemorragia espontânea gânglios basais. Um modelo em camundongos ICH oferece a vantagem da disponibilidade de animais transgênicos para investigar fisiopatologia, no entanto, seu pequeno tamanho faz com que procedimentos neurocirúrgicos mais tecnicamente difícil do que em animais maiores.
O modelo de colagenase e o modelo de injeção de sangue...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
O trabalho foi financiado por uma bolsa do Instituto de Medicina Translacional e Terapêutica, e uma bolsa de formação do Instituto de Medicina e Engenharia (T32HL007954) da Universidade da Pensilvânia e da Marlene L. Cohen e H. Jerome Fleisch Scholar Grant no University of Connecticut Health Center (LHS) e NIH NS-029331 (FAW).
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Materiais
Estereotáxica para neurocirurgia mouse (Stoelting, 51.925)
Bomba Microinfusion e processador (UMP-3 e MICRO4, instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL)
Rato mais quente (Stoelting, 50300)
Anestesia inalatória do mouse (Braintree Científico, EZ-AF9000)
25 mL estanques borosilicato seringa Hamilton com êmbolo revestido e sem agulha
(Hamilton empresa, Reno, NV, seringa 1702RN: 765401, ponteira: 30949, espaçador: 30946)
agulha de sílica fundida corte a 2 cm de comprimento (Hamilton, 17.739)
* Nota Hamilton seringa e agulha de sílica fundida pode ser reutilizada para múltiplas cirurgias se esterilizados antes de cada cirurgia. Estes materiais são cruciais para evitar a coagulação do sangue.
Luvas cirúrgicas estéreis
Bata cirúrgica, gorro e máscara
Betadine
Etanol 75%
estéril 27 g de agulhas (uso individual)
estéril seringa cc 1 (uso individual)
lâmina cirúrgica estéril
Cidex
água estéril
buprenorfina e isoflurano
gaze esterilizada
parafina quadrados de papel de cera
Cola cirúrgica veterinária (Vetbond, 3M, St. Paul, MN)
Referências
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
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Reimpressões e permissões
