Testículos Drosophila melanogaster pode ser rápida e eficiente isoladas dos machos adultos usando agulhas de dissecção. Com a prática, pode-se facilmente isolar em um ou dois dias uma quantidade de testes suficientes para a análise de DNA ou RNA por seqüenciamento de alto rendimento ou mais tradicionais métodos de biologia molecular ou de proteínas para ensaios de anticorpo ou enzima-based.
Artigo de método
Isolamento de Drosophila melanogaster Testes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os testículos de Drosophila melanogaster fornecer um importante modelo para o estudo de manutenção de células-tronco e diferenciação, a meiose, e soma-germline interações. Testículos são normalmente isoladas de machos adultos 0-3 dias após a eclosão do caso pupal. Os testículos de tipo selvagem moscas são facilmente distinguidos de outros tecidos, porque eles são o amarelo, mas os testículos de branco moscas mutantes, um fundo genético comum para experiências de laboratório são similares em forma e cor para o intestino da mosca. Realizar a dissecção de uma lâmina de vidro com um fundo preto torna a identificação dos testículos consideravelmente mais fácil. Testículos são removidos da voa usando agulhas de dissecção. Comparação com protocolos que utilize uma pinça para dissecção dos testículos, o nosso método é muito mais rápido, permitindo que um indivíduo bem praticada para dissecar testículos 200-300 do tipo selvagem voa por hora, produzindo 400-600 testículos. Testículos de moscas brancas ou de mutantes que reduzir o tamanho dos testículos são mais difíceis de dissecar e normalmente produzem 200-400 testes por hora.
Protocolo
- Faça uma lâmina de vidro com um fundo preto: Corte papel 20 # branco para o mesmo tamanho que a lâmina de microscópio. Lado uma cor do papel preto deslize tamanho usando um marcador permanente (por exemplo, a Sharpie). Aplicar cola branca (Elmer) para o lado negro e aderir o papel para o slide. O slide pode ser reutilizado. Usando ¾ "tape label (Fisherbrand), assegurar a lâmina de microscópio, com o lado de vidro para cima, para o bloco de voar CO 2 para corrigi-lo no lugar.
- Coletar 0-3 dias moscas macho velho.
- Prepare um balde de gelo, tampão fosfato (PBS), agulhas de dissecção.
- Anestesiar 5-10 voa usando um fluxo de CO 2 e transferi-los a partir da garrafa ou frasco para a plataforma de voar perto da lâmina de microscópio.
- Pipetar 50 ul ~ gelada PBS em uma queda no meio da lâmina de microscópio.
- Gentilmente pegar uma mosca do sexo masculino com a agulha de dissecação por imersão a agulha de dissecação em PBS, toque suave no lado ventral (isto é, perto das asas) da mosca-lo com a agulha no lugar gota de PBS.
- Coloque uma agulha no meio da mosca, entre o tórax eo abdômen, empurrando para baixo com firmeza. Coloque a outra agulha entre a sexta (A6) e (A7), sétimo segmentos abdominais (as listras segundo e terceiro do fundo); puxe o abdômen de distância do tórax.
- Tease os testículos para além de outros órgãos, especialmente o intestino. Especialmente em mutantes branco, testículos e intestino parecem semelhantes. Principais diferenças são que os testículos sempre vêm em pares, cada testículo tem um padrão de espiral e é mais do que na cor branca intestino.
- Armazenar os testículos na gelada PBS em um tubo de microcentrífuga de polipropileno.
Resultados representativos:
Figura 1. Vista dorsal do sistema reprodutor masculino, a partir de flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flubase atribuição:... "Depois de A Figura 38 na página 508 de Miller (1950) A. Miller A anatomia interna e histologia da imago de Drosophila melanogaster Em M. Demerec, editor, Biologia da Drosophila, capítulo 6, páginas 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, edição fac-similar de 1994. Copyright 1994 por Cold Spring Harbor Laboratory Press. Usado com permissão tipo de Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Press. Ver http://www.cshlpress.com ".
Discussão
Nós fornecemos um protocolo para isolar os testículos de adultos do sexo masculino Drosophila melanogaster. Porque a técnica exige uma coordenação de duas mãos, a habilidade só vem com a prática.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores agradecem Vasia Vagin para introduzir esta técnica em nosso laboratório.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Agulha de dissecação | Ferramenta | Fisher Scientific | S17346 | |
| Lâminas microscópicas, lisas | Ferramenta | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Luz de microscópio | Ferramenta | Schott AG | KO-1500 | |
| Placa de CO2 | Ferramenta | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Sistema completo Benchtop Flowbuddy | Ferramenta | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Umificador de bolhas | Ferramenta | Salter Labs | 7100 | |
| Agulha de enchimento com esfera | Ferramenta | Genesee Scientific | 54-119 | |
| Fita de etiquetas ¾” | Suprimento | Fisher Scientific | 15-901-5B |
Referências
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
Reimpressões e permissões
