Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Resumo

A junção neuromuscular (MNJ) de Drosophila melanogaster É um sistema modelo importante para o estudo da função sináptica normal, assim como perturbações de função sináptica encontrada em certas doenças neurológicas. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção da Drosophila Larval sistema motor e imunomarcação de proteínas zona ativa dentro do MNJ.

Resumo

As larvas Drosophila junção neuromuscular (MNJ) é um excelente modelo para o estudo da estrutura e função sináptica. Drosophila é bem conhecida pela facilidade de poderosas manipulações genéticas e do sistema nervoso das larvas tem-se revelado particularmente útil no estudo não só a função normal, mas também perturbações que acompanham algumas doenças neurológicas (Lloyd e Taylor, 2010). Muitos dos principais moléculas synaptic encontrados em Drosophila também são encontrados em mamíferos e como a maioria das sinapses excitatórias do SNC em mamíferos, o MNJ Drosophila é glutamatérgica e demonstra dependente de atividade de remodelação (Koh et al., 2000). Além disso, os neurônios Drosophila pode ser identificados individualmente, porque os seus padrões de inervação são estereotipados e repetitivos tornando possível estudo identificou terminais sinápticos, como aquelas entre neurônios motores e as fibras do corpo na parede muscular que eles inervam (Keshishian e Kim, 2004). A existência de componentes sinapse evolutivamente conservadas junto com a facilidade de manipulação genética e física tornar o modelo Drosophila ideal para investigar os mecanismos subjacentes função sináptica (Budnik, 1996).

As zonas de ativos nos terminais sinápticos são de particular interesse porque estes são os locais de liberação do neurotransmissor. NC82 é um anticorpo monoclonal que reconhece a proteína Drosophila Bruchpilot (BRP), um membro da família CAST1/ERC que é um componente importante da zona ativa (Wagh et al., 2006). Brp foi mostrado diretamente moldam a zona ativa T-bar e é responsável por efetivamente agrupamento Ca ^{2 +} canais abaixo da densidade de T-bar (Fouquet et al., 2009). Mutantes de Brp reduziram Ca ^{2 +} densidade de canais, a liberação da vesícula deprimido evocada, e plasticidade de curto prazo alterados (Kittel et al., 2006). Alterações às zonas ativas têm sido observadas em modelos de doenças Drosophila. Por exemplo, imunofluorescência usando o anticorpo NC82 mostrou que a densidade zona ativa foi diminuída em modelos de esclerose lateral amiotrófica e síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Assim, a avaliação das zonas de ativo, ou de outras proteínas sinápticas, em modelos de larvas de Drosophila da doença pode fornecer uma pista valiosa inicial para a presença de um defeito sináptico.

Preparar toda montagem dissecados larvas Drosophila para análise de imunofluorescência do MNJ requer alguma habilidade, mas pode ser realizado pela maioria dos cientistas com um pouco de prática. Apresentada é um método que fornece para as larvas múltiplos a ser dissecados e imunocoradas no prato dissecção mesmo, limitando as diferenças ambientais entre cada genótipo e fornecer animais suficiente para a confiança na reprodutibilidade e análise estatística.

Protocolo

1. Preparação para Imunofluorescência:

1. Para criar uma superfície de dissecação, despeje Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone em uma pequena placa de cultura de tecidos. Certifique-se de não encher o prato completamente para que a área de dissecção é menor do que o aro.
2. Guarnição pinos de dissecação para um comprimento de cerca de 3,5 mm para maior facilidade de manipulação, e certifique-se de ter pelo menos 6 pinos por larva.
3. Você vai precisar de uma pinça sem corte que permitirá que você alcance os pinos para a dissecção.

2. Dissecção das larvas:

1. Selecione vagando larvas de t....

Discussão

Para os neurônios, a área terminal sináptico é de fundamental importância, e é a ponte para a comunicação adequada entre o pós e pré-sináptica células. Uma forma poderosa para investigar a saúde do neurônio em modelos de doença é analisar proteínas do terminal sináptico por imunofluorescência. O método de imunofluorescência apresentado aqui permite que o pesquisador examine muitas larvas simultaneamente, limitar as diferenças ambientais entre os grupos. O sistema nervoso central de Drosophila larvas do terceiro.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número Catálogo	Comentários
Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone	Dow Corning	68037-59-2	Após a mistura permitir bolhas a subir lentamente para fora, colocando em rotator lenta ou permita a sentar-se por 30 minutos ou mais.
Aço Inoxidável PINs Minutien	Multa Ferramentas Ciência	26002-10	Guarnição para aprox. 3-4mm de comprimento, com tesouras regulares
Pinça laminectomia (Blunt-Usado para agarrar pinos)	Multa ferramentas da Ciência	11223-20	Use como uma pinça para agarrar blunt pinos
Pinça dissecção	Precision Instruments mundo	501985
SuperFine Tesoura Vannas, 8cm longo	Precision Instruments mundo	501778
Rato de anticorpos anti-Brp	DSHB	NC82	Use diluição 1:50
Cy3 Goat Affinipure Peroxidase Anti-rábano	Immunoresearch Jackson	123-165-021	Use a diluição de 1:200
Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG	Invitrogen	A11001	Use aprox. Diluição de 1:200