Caracterização do isolado, ventilado, Lung Mouse e Instrumentados perfundidos com fluxo pulsátil

Resumo

O protocolo a seguir descreve o processo de isolamento, ventilação e instrumentação pulmões do rato para medir estável ou pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações, a fim de quantificar os efeitos do fluxo sanguíneo, o fluxo de ar, alterações das vias aéreas e alterações vasculares no pós-carga do ventrículo direito.

Resumo

O isolado, ventilado e instrumentado preparação de pulmão do rato permite constante e pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relacionamentos para ser medido com controlo independente sobre a taxa de fluxo arterial pulmonar, forma de onda vazão, pressão das vias aéreas e da pressão atrial esquerda. Resistência vascular pulmonar é calculado com base multi-ponto, constante pressão de fluxo de curvas; impedância vascular pulmonar é calculado a partir pulsátil da pressão do fluxo de curvas obtidas em uma faixa de freqüências. Como agora reconhecida clinicamente, impedância é uma medida superior de pós-carga ventricular direita do que a resistência, pois inclui os efeitos da complacência vascular, que não são desprezíveis, principalmente na circulação pulmonar. Três métricas importantes de impedância - o zero hertz impedância Z _0, a impedância característica Z _C, eo índice de reflexão da onda R _W - fornecer a introspecção em distal área transversal disponível para o fluxo arterial, rigidez arterial proximal e da impedância a montante ea jusante incompatibilidade, respectivamente. Todos os resultados obtidos no isolado, ventilado e pulmões perfundidos são independentes do tônus ​​do sistema nervoso simpático, o estado do volume e os efeitos da anestesia. Temos utilizado esta técnica para quantificar o impacto de embolia pulmonar e hipóxia crônica sobre a resistência e impedância, e para diferenciar entre sítios de ação (ie, proximal versus distal) de drogas vasoativas e doenças usando a dependência da pressão de Z _C. Além disso, quando estas técnicas são usadas com os pulmões de linhagens geneticamente modificadas de ratos, os efeitos do nível molecular defeitos na estrutura e função vascular pulmonar pode ser determinada.

Protocolo

Neste protocolo, demonstramos um isolado, ventilado, preparação de pulmão perfundido de rato que tenha sido utilizado para quantificar o impacto de embolia pulmonar e hipóxia crônica em pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações (Tuchscherer, Webster, e Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). Em breve, os pulmões do rato são cirurgicamente isolada dos tecidos adjacentes, colocados em uma câmara climatizada (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) e ventilado (Módulo de Controle Ventilatório (VCM)-R com timer módulo contador (TCM); Harvard aparelhos). A vasculatura pulmonar é perfundido com aquecida meio de cultura RPMI 1640 celular com Ficoll 3,5% usando uma bomba de seringa (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) para gerar o constante fluxo de formas de onda ou uma bomba de alta freqüência oscilatória (Bose-Electro Force, Eden Prairie, MN) em paralelo com a bomba de seringa para criar pulsátil de fluxo vascular pulmonar formas de onda. Transdutores de pressão (P75, Aparelho Harvard) medir a pressão da artéria pulmonar instantânea (PAP) ea pressão atrial esquerda (PAE). Vazão instantânea (Q) é medido com um medidor de fluxo de in-line (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos são derivados a partir dessas medições, que fornecem insights sobre vascular pulmonar fisiologia e patologia e pós-carga do ventrículo direito.

1. Equipamento:

1. Pulmão isolado set-up, incluindo ventilador do mouse
2. Sistema de aquisição de dados e computador com programa LabView
3. Dois transdutores de pressão e medidor de vazão para o fluxo de perfusato
4. Transdutor de pressão e medidor de vazão (pnemotachometer) para o fluxo das vias aéreas
5. Bomba de alta freqüência oscilatória e computador com Win programa de teste
6. Lança / zoom microscópio da lâmpada,
7. Banho de aquecimento com bomba de alto débito para o sistema IL-1

2. Preparando o sistema IL-1

1. Água destilada aquecida a 37 ° C por banho de aquecimento é distribuída para o interior da IL-1 do sistema.
2. Todas as bombas, e transdutores a IL-1 cânula são conectados através de tubos limpos e toda a tubulação é lavada com água destilada aquecida a 37 ° C. Bolhas de ar, o que poderia viajar para o pulmão e causar edema, deve ser removido. Tubulação da bomba de fluxo oscilatório para o sensor de fluxo e do sensor de fluxo para a cânula da artéria pulmonar são lavados com PBS 1%.
3. O P75 transdutores de pressão são zerados, fechando a válvula para a cânula, a abertura das válvulas para a atmosfera e, em seguida, apertar o botão automático de zero do amplificador PLUGSYS. Então, a válvula para a atmosfera é fechada ea válvula para a cânula aberto.
4. A peça de cerâmica porosa na via de ventilação do sistema de IL-1 é molhada para fornecer umidade.

3. Soluções

1. Prepare 3,5% por volume de solução de Ficoll-RPMI filtro estéril e os meios de comunicação. Filtragem a mídia garante que não haja grandes partículas que poderiam involuntariamente embolize o pulmão. Usando meios estéreis também reduz a probabilidade de edema súbito desenvolvimento no pulmão. Preencher uma seringa de 10 ml com RPMI para cirurgia e uma seringa de 60 ml com RPMI para cada ensaio experimental. Aqueça o perfusato a 37 ° C banho-maria.
2. Prepare 1ml de peso corporal heparina 500IU/100g do mouse (aproximado). O sal de heparina é 158IU/mg. Para um rato g ~ 25, mix 1,25 mg de sal heparina com 1ml solução PBS em um tubo de microcentrífuga de pequeno porte.

4. Ventilar um rato

1. Após uma injeção intraperitoneal de pentobarbital 150 mg em solução por quilograma para o mouse, garantir a anestesia profunda, realizando uma pitada rígido em uma pata. Se não houver reação, preparar o mouse para a cirurgia fixando suas patas da frente para corkboard para a estabilidade. Nota: Durante todo o experimento profundidade anestésica é monitorado observando cuidadosamente o animal. Os pinos nas patas e incisões freqüentes atuar como estímulos nocivos, a falta de resposta a que confirma que o animal permanece em um plano cirúrgico de anestesia.
2. Pulverizar o peito com álcool a 95% para molhar as de pele e utilize uma pinça reta para agarrar a pele no pescoço. Corte de 1 cm de abertura na pele com a tesoura reta.
3. Uma vez que o interior do gargalo está exposta, remover todo o tecido glandular e músculo branco superficial, olhando para o esôfago e traquéia. Isolar o esôfago e traquéia do tecido em ambos os lados e posteriormente.
4. Inserir a pinça pequena dobrada sob a traquéia e pegar um pedaço de fio do outro lado. Puxe a sutura sob a traquéia e dê um nó frouxo cirurgiões. Não aperte a sutura ou amarrar o nó.
5. Um pequeno corte em ângulo "v" na traquéia com uma tesoura pequena, não cortar todo o caminho através da traquéia. Mover a placa da cortiça e do rato para a IL-1 aquecida sistema. Usando as duas pinças blunt, pegue a cânula traqueal e da traquéia abaixo do "v". Então, deslize a cânula traqueal no tracheA através do "v" de abertura. Aperte a sutura em torno de traquéia e cânula traqueal para garantir a cânula dentro da traquéia. Amarrar o nó.
6. Iniciar ventilação (inspiração de 50%, 90 respirações / min, com a inspiração profunda) com ar ambiente.

5. Perfusão um rato ventilado

5.1. Acessar o ventrículo direito para injetar heparina

1. Pulverizador do peito do rato com álcool novamente para re-molhar a pele. Retire toda a pele no peito acima das costelas com a pinça em linha reta e tesoura reta. Corte para cima ao longo do esterno. Levante a pele em cada lado e depois cortar a pele, seguindo a linha das costelas inferiores.
2. Compreender o processo xifóide, na parte inferior do esterno com uma pinça e cortar um buraco no diafragma usando a tesoura reta. Agarre o diafragma com a pinça e corte-o longe das costelas.
3. Compreender o processo xifóide novamente com a pinça (mão esquerda) e use a bola ponta, tesoura angulada para cortar o esterno e costelas por meio, tomando cuidado para não cortar os pulmões, coração ou dos vasos sanguíneos (use a bola ponta-on a tesoura para guiá-lo). Haverá sangue, mas desde que a ponta da tesoura é contra o esterno, o coração e os pulmões não será cortado.
4. Segure as costelas do lado esquerdo e cortar o máximo de costelas, conforme necessário para expor o coração. Injecte lentamente o ventrículo direito com 0,1 ml solução de heparina. Este passo é importante para prevenção de coágulos de sangue no pulmão, que danificam as células endoteliais e irá prejudicar a perfusão. A heparina deve ser injetado enquanto o coração ainda está batendo.

5.2. Canular a principal artéria pulmonar

1. Cortar o resto das costelas (lado esquerdo e direito), usando as costas (arredondado) final do fórceps para empurre os pulmões de distância da parede torácica. Agarrando os pulmões se irá danificar o tecido delicado. Contato acidental entre as pontas de tesoura eo tecido pulmonar também irá causar danos.
2. Mover o microscópio no lugar sobre pulmão. Cortar o tecido glandular e gordura na parte superior do coração. Use a pinça para retirá-lo longe das artérias e veias e depois corte com a tesoura primavera, enquanto o tecido é em tensão.
3. Usando um outro conjunto de pinças blunt, colher da direita para a esquerda da parte superior do coração sob átrio esquerdo / ventrículo para chegar a ponta da pinça sob a aorta ea artéria pulmonar (PA). Faça isso com cuidado, não deve haver resistência para as pinças. Usando uma pinça sem corte reduz a probabilidade de acidentalmente punção da artéria pulmonar ou aorta.
4. Uma vez que a ponta pinça está sob a aorta e AP, pegue um pedaço de sutura e sobreviver. Dê um nó frouxo cirurgiões. Não aperte a sutura ou amarrar o nó.
5. Opcional: use a tesoura angulada para remover a metade inferior do corpo. Cortar através das costelas e coluna vertebral; corte a aorta ea veia cava fará com que uma quantidade significativa de sangue flua - use um Q-dica para estancar o fluxo. Coloque em um saco para descarte.
6. Primeiro-PA cânula com 4 ml de uma seringa de 10 ml de RPMI. Verifique se toda a tubulação está livre de bolhas de ar. Perfusão do pulmão com água destilada ou bolhas resultará em edema.
7. Corte um pequeno entalhe na parede livre do ventrículo direito e inserir a cânula PA, que aponta para baixo e à direita. A ponta da cânula deve ser visível através da parede transparente do PA. Infundir uma pequena quantidade de RPMI para confirmar a sua localização. Aperte a sutura ao redor da cânula aorta, e PA e amarrar o nó. Note que, neste ponto, a aorta também é amarrado para perfusão real não deve começar até o átrio esquerdo canulado é.

5.3. Canular o átrio esquerdo

1. Corte um entalhe na parte inferior do ventrículo esquerdo e inerte do átrio esquerdo (LA) cânula, visando cima. Leve pressão pode ser necessário para abrir a válvula mitral nessa direção. No local correto, a ponta da cânula vai escorregar completamente e ser seguro, sem sutura.

5.4. Comece a perfusão

1. Manualmente infundir RPMI da seringa de 10 ml a 0,3 ml por minuto até RMPI é evidente na tubulação de saída (rosa-ish cor em contraste com o PBS claro). Se não há fluxo na saída de tubulação, re-posição da cânula LA. Se nenhuma saída pode ser obtida com re-posicionamento, verifique se há um vazamento na artéria pulmonar. Um vazamento ou ruptura na artéria pulmonar não pode ser reparado, o que é motivo para abortar o experimento.
2. Conecte uma seringa de 60 ml para a cânula PA através da IL-1 do sistema e começar a infusão 1mL/min de perfusato, verificação de vazamentos e certificando-se nos pulmões ficam brancos, o que mostra que RPMI está substituindo o sangue nos pulmões. Perfundir com fluxo lento por dois minutos.

6. Medição pulsátil e constante pressão pulmonar Fluxo de Relacionamentos

1. Para os estudos de fluxo pulsátil, primeiro defina os deslocamentos de pistão oscilatório bomba emos níveis desejados para cada freqüência na WinTest programa baseado em experiências anteriores. Variabilidade devido na estrutura pulmonar e mecânica, os deslocamentos devem ser ajustados para cada rato. Definir fluxo constante para o nível desejado. Abra a válvula na bomba oscilatório e começar a gravação de dados direito antes de executar o perfil de fluxo oscilatório (programa Wintest). Abra o arquivo de dados e traçar o fluxo experimental (Q) em Excel. Ajuste os deslocamentos de pistão oscilatório bomba em cada frequência (programa Wintest) de modo que Q e Q max min são tão desejado.
2. Para ensaios de fluxo constante, fechar a válvula na bomba oscilatório. Se essa válvula é deixada aberta, a bomba oscilatório age como um capacitor, amortecendo as mudanças de uma taxa de fluxo para o outro. Coletar dados para pelo menos 10 segundos a cada taxa de fluxo ou até que a pressão PA não muda por mais de 5%.
3. Para medições de vazão ou pulsátil ou contínuo, ventilação velhos a uma pressão constante antes da coleta de dados. Retomar a ventilação imediatamente após a coleta de dados.
4. Preste atenção para RPMI na tubulação das vias aéreas, isto é evidência de edema e é motivo para abortar o experimento. Além disso, não deixe RPMI atingir a pressão das vias aéreas ou sensores de fluxo, pois irá danificar os transdutores.

7. Resultados representativos:

Resultados representante constante:

No pulmão isolado set-up o pesquisador tem a capacidade de controlar de forma independente, não só o fluxo pulmonar Q mas também as vias aéreas pressão P _{do ar} e deixou LAP pressão atrial. Isto é vantajoso porque Q, P _ar e LAP influenciar a vasculatura pulmonar e consequente PAP pressão da artéria pulmonar. Outra vantagem é que os resultados obtidos são independentes do tônus ​​do sistema nervoso simpático ^1, status de volume e anestesia ^2.

PAP alterações induzidas pela escada-Q para mudanças na fixa P _ar e fixa ou variável LAP são mostrados na Figura 1. Note-se que na preparação de pulmão isolado, a cânula LAP está normalmente ligado ao tubo que direciona o perfusato em um recipiente de resíduos. Com este tubo no lugar, LAP é linearmente dependente Q devido ao fluxo de Poiseuille. No entanto, a altura da tomada e recipiente de resíduos pode ser ajustado manualmente para fornecer uma constante, LAP não-zero ou a tubulação pode ser removido para permitir de zero LAP que é independente de Q.

Representante Resultados pulsátil:

Enquanto arbitrária pulsátil do fluxo de onda pode ser gerada com este sistema, que normalmente geram fluxo da forma Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min, nas freqüências de f = 1, 2, 5, 10, 15 e 20 Hz para avaliar a impedância linearizada da vasculatura pulmonar (Figura 2: painel superior). A partir das medições resultantes LAP PAP, e Q, magnitude da impedância vascular pulmonar (Z) e fase (θ) são calculados pela primeira decomposição um ciclo completo da AP sinusoidal = PAP LAP-Q e em cada frequência sinusoidal taxa de fluxo de impostos em uma série de harmônicos sinusoidal usando uma transformada de Fourier. A relação da pressão de transformar a fluir rendimentos transformar a impedância vascualar pulmonar, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), que tem magnitude Z e fase θ. Impedância de entrada Z _0, impedância característica Z _C, e índice de reflexão da onda R _W, são calculados a partir da magnitude da impedância. Em particular, Z ₀ é calculado a partir de Z a 0 harmônica (f = 0 Hz), calculados sobre todas as freqüências, Z _C é calculada como a média de Z entre o mínimo primeiro (5 Hz) e 20 Hz, e R _W é calculado como (Z-Z _{0 C)} / (Z + Z _{0 C)} ^3.

Figura 1 constante fluxo de formas de onda (linha superior) e as pressões resultantes. (Segunda linha: PAP, P _ar, LAP) em função do tempo com diferentes combinações de LAP e _ar P. A linha inferior mostra PAP vs P. Em (A) e (B), aumenta e diminui com LAP Q porque a tubulação de saída foi no lugar. Esta tubulação foi removido para (C) de modo que LAP é constante e independente de P. Em (D) e (E) a altura da tubulação de saída foi ajustada manualmente para que LAP é maior, mas independente do Q. P _ar era tanto a inspiratório final (A, C, D) ou pressão expiratória final (B, E).

Figura 2 fluxo pulsátil forma de onda Q (painel superior) e as pressões resultantes (painel inferior: PAP LAP, e P _ar). Como uma função do tempo. A partir dessas pulmonar pulsátil da pressão do fluxo de relacionamentos, PVZ pode ser calculado, o que reflete a pós-carga ventricular total direita.

Discussão

Etapas críticas na cirurgia

É fundamental que se tenha o cuidado ao cortar a caixa torácica longe dos pulmões. Os pulmões devem ser completamente expostos e desinibida por tecidos em volta durante a inflação, mas não danificada durante o processo de isolamento. O uso de um objeto liso como o back-end da pinça pode ser usada para manter os pulmões de distância da parede torácica para que haja um caminho claro para a tesoura para cortar. Outro passo fundamental é a colocação da sutura ao redor da...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 ml	Fisher Scientific	14-829-10F
Seringa de 10 ml	Fisher Scientific	14-823-2A
Seringa de 60 ml	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI com GLN 6/PK	Fisher Scientific	MT10040CV
Filtros de Topo de Garrafa	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100g
Heparina	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Tesoura de íris de bola angular	Fine Science	Tools 14109-09
- lâminas de 4mm	Fine Science Tools	15018-10
- reta	Fine Science Tools	14106-09
Dumont #5/45 Fórceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont Medical Biology Fórceps	Fine Science Tools	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	Comparável ao Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 Sistema de pulmão de camundongo perfundido isolado	Harvard Apparatus	739904
Transdutor de pressão arterial P75 para módulo PLUGSYS	Harvard Apparatus	730020
TS410 Módulos de fluxo	Transônico	TS410
ME 4 PXN Sensores de fluxo em linha PXN de precisão	Transônico	ME 4 PXN
Cole-Parmer	Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG / ML 20ML Frasco	Amatheon