Descrevemos os métodos fotobranqueamento inclusive Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) para monitorar a dinâmica de proteínas da cromatina no tronco embrionárias (ES) células. Proteínas da cromatina dinâmica, que é considerado um dos meios para estudar a plasticidade da cromatina, é reforçada em células pluripotentes.
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Artigo de método
Fotobranqueamento Ensaios (FRAP & FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) permitem o estudo da dinâmica de proteínas em células vivas, com resolução espacial e temporal bem. Aqui nós descrevemos como executar FRAP e ensaios FLIP de proteínas da cromatina, incluindo H1 e HP1, em tronco embrionárias de camundongos (ES) células. Em um experimento FRAP, as células são transfectadas, seja transitoriamente ou de maneira estável, com uma proteína de interesse em fusão com a proteína verde fluorescente (GFP) e suas derivadas (YFP, PCP, Cherry, etc.) No transfectadas, as células fluorescentes, um feixe de laser intenso focado alvejantes uma região relativamente pequena de interesse (ROI). O comprimento de onda do laser é selecionado de acordo com a proteína fluorescente usada para a fusão. A luz do laser de forma irreversível o sinal alvejantes fluorescentes de moléculas no ROI e, imediatamente após o branqueamento, a recuperação do sinal fluorescente na área branqueada - mediada pela substituição das moléculas branqueada com as moléculas crus - é monitorado usando imagens de lapso de tempo. Gerada curvas de recuperação de fluorescência fornecer informações sobre a mobilidade da proteína. Se as moléculas fluorescentes são imóveis, nenhuma recuperação de fluorescência será observado. Em uma abordagem complementar, perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP), o feixe de laser alvejantes mesmo lugar repetidamente e da intensidade do sinal é medido em outras partes da célula fluorescentes. Experimentos FLIP, portanto, medida de decaimento do sinal, em vez de recuperação de fluorescência e são úteis para determinar a mobilidade de proteínas assim como a proteína vaivém entre compartimentos celulares. Vinculação transitória é uma propriedade comum da cromatina proteínas associadas. Embora a maior fração de cada proteína cromatina é obrigado a cromatina em um dado momento no estado estacionário, a ligação é transitória e proteínas mais cromatina têm uma alta rotatividade de cromatina, com um tempo de residência na ordem de segundos. Estas propriedades são cruciais para a geração de elevada plasticidade no genoma de expressão 1. Experimentos fotobranqueamento são, portanto, particularmente útil para determinar plasticidade cromatina usando GFP fusão versões da cromatina proteínas estruturais, especialmente em células ES, onde a troca dinâmica de proteínas da cromatina (incluindo heterocromatina proteína 1 (HP1), histona H1 linker e histonas core) é maior do que em células diferenciadas 2,3.
Protocolo
1. Chapeamento as células ES
T = 0 hrs
Plating MEF
- Brasão da imagem live 8 bem-μ-Slides (ibidi; Munique, Alemanha) com gelatina ou em copos chambered tampa (Lab-Tek, Rochester, NY) ou em pratos de vidro de fundo de cultura (Mattek; Ashland, MA). Deixe por 50-30 min e aspire a gelatina de distância livre.
- Semente 22.000 MEFs / poço em 250 mL de volume total de DMEM [suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS)]. Permitem que as células a crescer em uma cultura de tecidos incubadora (37 ° C, 5% de CO2).
T = 6 horas
ES revestimento celular
- Aspirar DMEM. <....
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Discussão
Ao contrário das técnicas mais disponíveis, que envolvem cromatina purificada a partir de populações de células ou células fixas, experimentos FRAP seguir as mudanças na dinâmica de proteínas da cromatina em células vivas. Encontramos dinâmica de proteínas da cromatina para ser um bom indicador para a plasticidade da cromatina. No entanto, porque requer a fusão do gene de interesse com GFP, a adição da tag fluorescentes podem interferir com a função da proteína. Assim, antes de prosseguir com FRAP, a proteína de fusão d.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a membros do laboratório Meshorer, especialmente Shai Melcer, Adi Alajem, Edupuganti Raghu Ram, Badi Sri Sailaja, Anna Mattout e Alva Biran, por comentários críticos e para a resolução de problemas experimentos fotobranqueamento em uma base diária. EM é um H. José e Belle R. Braun Professor de Ciências da Vida e é apoiado pela Fundação Ciência Israel (ISF 943/09), o Ministério da Saúde, Israel (6007) da União Europeia (IRG-206872 e 238176), Israel Cancer Research Foundation, o Internal Applicative Grants de Medicina da Universidade Hebraica e do Instituto de Psicobiologia Israel.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Gelatina | Merck | 1,04078 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985 | |
| Trânsito LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| 8-bem-μ Slides | ibidi | 80826 |
Referências
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E.
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Reimpressões e permissões
