Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Resumo

Xenopus ectoderma embrionário tornou-se um modelo atraente para os estudos da polaridade celular. Um ensaio é descrito, em que a distribuição subcelular de proteínas fluorescentes é avaliada em células ectoderma. Este protocolo vai ajudar abordar as questões relacionadas ao controle espacial de sinalização.

Resumo

Polaridade celular é uma propriedade fundamental das células eucarióticas que é dinamicamente regulada por fatores intrínsecos e extrínsecos durante o desenvolvimento embrionário ^{1, 2.} Uma das vias de sinalização envolvidas neste regulamento é o caminho Wnt, que é usado muitas vezes durante a embriogênese e críticas para a doença humana ^{3, 4, 5.} Múltiplos componentes moleculares desta via coordenadamente regular a sinalização de uma forma espacialmente restrito, mas os mecanismos subjacentes não são totalmente compreendidos. Células embrionárias epiteliais Xenopus é um excelente sistema para o estudo de localização subcelular de várias proteínas de sinalização. Proteínas de fusão fluorescentes são expressos em embriões Xenopus por microinjeção RNA, explantes ectodérmica são preparados e localização de proteínas é avaliado por epifluorescência. Neste protocolo experimental que descrevem como localização subcelular de Diversin, uma proteína citoplasmática que tem sido implicado na sinalização celular e determinação de polaridade ^{6, 7} é visualizado em células Xenopus ectodérmica para estudar transdução de sinal Wnt ^8. Co-expressão de um ligante Wnt ou um receptor Frizzled altera a distribuição de Diversin fundido com proteína fluorescente vermelha, RFP, e recruta-o para a membrana celular de uma forma polarizada ^{8, 9.} Este protocolo ex vivo deve ser uma adição útil para estudos in vitro de culturas de células de mamíferos, em que o controle espacial de sinalização difere daquela do tecido intacto e é muito mais difícil de analisar.

Protocolo

1. Fertilização In Vitro de Xenopus Ovos

1. Obtenção dos ovos de rãs do sexo feminino que foram injetados com gonadotrofina coriônica humana (400 unidades / rã) 12 horas antes do experimento.
2. Coloque os ovos em uma pequena quantidade (0,5-1 ml) de uma solução de Ringer x Marc modificados (MMR) ¹⁰ a os ovos e fertilizá-los in vitro com um pequeno pedaço de testículos dissecados. Depois de 2-3 min, adicione 0,1 x MMR para cobrir toda a superfície dos ovos. Em 20 minutos, o ovo casaco geléia é removido por cisteína 3% - HCL (pH ajustado para 8 com hidróxido de sódio). Os ovos são lavados com 0,1 x MMR três vezes e ....

Discussão

Temos utilizado o protocolo acima para caracterizar a localização subcelular de Diversin. Em explantes pólo animal, Diversin-RFP foi detectado junto ao núcleo e colocalized com g-tubulina, um marcador centrosomal, em criosecções (Figura 1). Uma vez que a localização subcelular de uma proteína é identificada, constrói a exclusão pode ser gerado para estabelecer quais domínios de proteína são necessárias e suficientes para a localização subcelular. Usando essa abordagem, os domínios de localização centrosomal de Diversin .......