Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Resumo

Neste vídeo, descrevemos um método para imagens de células vivas de células em divisão assimétrica órgão sensorial progenitoras e células epidérmicas em intacta Drosophila Pupas

Resumo

Desde a descoberta da proteína verde fluorescente (GFP), tem havido uma mudança revolucionária no uso de live-imaging celular como uma ferramenta para a compreensão de mecanismos biológicos fundamentais. Progresso notável tem sido particularmente evidente em Drosophila, cuja extensa toolkit de mutantes e linhagens transgênicas fornece um modelo conveniente para estudar evolutivamente conservada de desenvolvimento e de células mecanismos biológicos. Estamos interessados ​​na compreensão dos mecanismos que controlam a especificação de destino das células no sistema nervoso periférico de adultos (PNS) em Drosophila. Cerdas que cobrem a cabeça, tórax, abdômen, pernas e asas da mosca adulta são individuais órgãos mecanosensorial, e têm sido estudados como um sistema modelo para entender os mecanismos de Notch dependentes de decisões destino da célula. Sensoriais órgão precursor (SOP) células do microchaetes (ou pequeno cerdas), estão distribuídos por todo o epitélio do tórax pupal, e são especificados durante as primeiras 12 horas após o início da pupariation. Após a especificação, as células começam a se dividir SOP, segregando o determinante destino celular Numb para uma célula filha durante a mitose. Funções Numb como um inibidor de células-autônoma da via de sinalização Notch.

Aqui, mostramos um método para acompanhar a dinâmica de proteínas na célula SOP e sua progênie dentro do tórax intacto pupal usando uma combinação de tecido-específicos Gal4 motoristas e GFP-tagged fusão ^1,2 proteínas. Esta técnica tem a vantagem sobre o tecido fixo ou cultivadas explantes, pois nos permite acompanhar todo o desenvolvimento de um órgão de especificação das precursoras neurais para o crescimento e diferenciação terminal do órgão. Podemos, portanto, correlacionar diretamente as mudanças no comportamento de células de alterações na diferenciação terminal. Além disso, podemos combinar a técnica de imagem ao vivo com a análise de mosaico com um marcador de células repressor (MARCM) do sistema para avaliar a dinâmica de proteínas marcado em SOPs mitótica em condições mutante ou tipo selvagem. Usando esta técnica, nós e outros revelaram percepções romance em regulação da divisão celular assimétrica eo controle da ativação de sinalização Notch em células SOP (exemplos incluem referências ^{1-6,7, 8).}

Protocolo

Materiais necessários: Dissection estereomicroscópio, fita dupla face, lâmina de microscópio padrão e lamínula, pinça de dissecção (tamanho 5 ou 5.5), escova de cerdas macias, graxa de silicone a vácuo, seringa 5cc, papel Whatman, ou confocal microscópio de epifluorescência, com câmera digital e imagem software de aquisição.

1. Dissecação de pupa

1. Estabelecer uma cruz (usando a combinação apropriada de Gal4 linha e uma proteína de fusão GFP tagged sob controle UAS) ou moscas lugar a partir de um estoque que você deseja para a imagem em vários frascos fresco a 25 ° C.
2. Células SOP geralmente começam a proliferar no tórax pupal em 18 horas após o início da pupariation, nós, portanto, selecionar pupas "branco" do estoque voar apropriado ou cruz. Branco pupas têm a morfologia pupal, mas têm um caso unpigmented pupal, indicando que que pupariated dentro da hora.
3. Espere aproximadamente 18 horas.
4. Coloque um pedaço de fita dupla-face para o slide. Coletar pupas e aderir caso pupal para a fita dupla-face com o lado ventral para baixo. Segure a borda do opérculo (a escotilha circular na ponta dorsal anterior do caso de pupa) com a pinça
5. Levante cuidadosamente, remover e descartar o opérculo, revelando a cabeça da mosca imaturo.
6. Use a pinça para começar a rasgar ao longo do lado do caso pupal. Levante a secção central do caso pupal do lado rasgado e trazê-lo para o lado oposto, ou removê-lo completamente ou anexá-lo à fita, revelando a porção anterior do tórax e do abdômen. (: Existe uma lacuna entre a voar em desenvolvimento e caso pupal. Tenha cuidado para não perfurar a voar como a parede da caixa é rasgada.)
7. Comece cortando ao longo do mesmo lado do caso pupal para o fim posterior. Mais uma vez, tome cuidado para não perfurar a voar. Puxe o caso pupal para o lado oposto da mosca e pressione-o para a fita dupla face. O abdômen deve estar totalmente exposta. Coloque a escova de cerdas macias diretamente abaixo da cabeça da mosca. Uma vez que a mosca está presa ao pincel e livre do caso de pupa, use a escova para levantar delicadamente a voar fora do slide.

2. Montagem de pupa

Após a dissecção, pupas são então montadas entre lâmina e lamínula:

8. Pupas Isolated removido caso pode então ser colocado no centro de um lado dorsal de vidro deslizar para cima.
9. Faça uma moldura quadrada de papel Whatman 18X18mm deixando uma abertura de 10x10 mm no meio. Papel mergulhe em água até à saturação. Lugar em torno da pupa.
10. Usando uma seringa de 5 cc preenchido com graxa de vácuo silicone, aplique uma camada uniforme de gordura ao redor da moldura Whatman. A camada de graxa deve caber dentro da lamela (Figura 1) ea espessura deve ser apenas um pouco maior que o diâmetro de pupa.
11. Coloque uma pequena gota de água (1 ml) no centro de uma lamela 22x22 milímetros e coloque a lamínula sobre a preparação acima de tal forma que os contatos pequena gota de água da superfície que você deseja notum imagem, neste caso). Comprimir delicadamente para formar uma vedação de graxa de vácuo e superfície de contato plana entre as lamelas e cutícula pupal.
12. Prep pode então ser trabalhada em microcopes invertido ou vertical, usando epifluorecence, confocal (varredura a laser ou spinning tipo de disco) ou confocal de dois fótons. Se você for cuidadoso, moscas adultas podem ser recuperadas depois de vários dias.

3. Resultados representativos:

Usando uma linha de SOP específico Gal4 ( Neuralized-Gal4) cruzou a proteínas GFP marcadas para rotular o fuso mitótico (tubulina ou Tau-GFP) ou proteínas histonas (H2B-GFP), pode-se observar avião divisão da SOP divisão celular, o comprimento do ciclo celular, ou o número de mitose divisões usando lapso de tempo de imagem ⁹. Outras proteínas de fusão que visam organelas celulares como Rab-GTPases para marcar diferentes compartimentos endocítica (Rab5-GFP para o início de endossomos ou Rab11 GFP para reciclagem endossomos) ou proteínas importantes na regulação de sinalização Notch (Numb, sócio da Numb-GFP, ou Sanpodo -GFP) pode gerar importantes insights sobre os mecanismos de divisão celular assimétrica e tráfico de proteína de membrana ^2,3,7,10,11.

Figura 1: dissecção pupa e montagem. A. Passo-a-passo imagens mostram o procedimento para remover o caso pupal e preparar pupas intactas para imagens de células de montagem e ao vivo. Pupas são removidos do frasco e colocadas, lado dorsal para cima, em fita dupla pau anexado a uma lâmina de vidro. Primeira coluna, a remoção do opérculo e rasgando ao longo do lado do caso pupal. Segunda coluna, a remoção do caso pupal da região torácica e abdominal. A pupa livre é, então, levantada a partir do caso pupal usando uma escova de cerdas macias. B. Montagem pupas entre lâmina e lamínula. Pupa é colocado dorsal do lado em cima da lâmina de vidro, rodeado por uma moldura de papel Whatman umedecido. Um cordão contínuo de silicone graxa de vácuo extrudados a partir de uma seringa 5cc funções para selar a combinação de slides lamela, protegendo a pupa de dessecação e elevando a lamela por isso descansa suavemente sobre o tórax pupal. Uma pequena gota de água (1 ml) na interface entre as lamelas e cutícula tórax melhora significativamente a qualidade da imagem quando usar objetivas de imersão (água ou óleo). Clique aqui para ver uma imagem maior.

Figura 2: Imagens representativas de células SOP viver e externa diferenciada órgãos sensoriais tomadas usando nosso dissecção pupal e montagem procedimento. A. Imagens extraídas de uma série temporal de uma célula mitótica SOP expressar actina-proteína de fusão GFP sob o controle do Neuralized- Gal4 ( Neur- Gal4/UAS-actin-GFP), note acúmulo de actina cortical no sulco de clivagem (1 image / a cada 2 minutos). B. Células-filhas SOP co-expressando Parceiro de Numb-RFP (vermelho) e Rab5-GFP impulsionado por Neuralized- Gal4, observe a distribuição assimétrica de Pon-RFP em uma célula-filha (pIIb) e distribuição de endossomos iniciais em ambas as células-filhas. C. Renderização de volume de um z-series consideração diferenciada externa órgãos sensoriais numa fase tardia pupal. Estruturas de cutícula, como mechnosensory cerdas e pêlos epidérmicos são revelados por cutícula autofluorescência (vermelho). Além disso, usamos o sistema MARCM para expressar LGL-GFP (dirigido por Neuralized- Gal4) em um subconjunto de células sensoriais do órgão precursor (verde). (Estas imagens foram adquiridas usando uma Nikon C1 microscópio de varredura confocal usando um objetivo 60X 1,45 NA)

Discussão

Neste vídeo, que ilustram uma técnica para isolar e montagem Drosophila Pupaefor imagens de células vivas de células SOP na notum pupal. Remoção de pupas do caso pupal exige uma mão firme, ferramentas apropriadas, e alguma prática, mas é fácil de aprender. É importante que encenação de pupas ser feito com precisão, a fim de garantir relativa facilidade de dissecção e pegar a fase de proliferação de desenvolvimento SOP. Uma vez montado, pupas continuará a desenvolver-se entre lâmina e lamínula, e na maioria dos casos, chegará à fase adulta pharate e, eventualmente, Eclose. Em nossa experiência, a célula pode ser trabalhada ao longo de várias horas. Esta técnica de montagem não se limita à observação de células precursoras de PNS no tórax pupal, mas pode ser usado para visualizar todas as células que estão próximas à superfície da cutícula e acessível para a objetiva do microscópio, (note que as observações são feitas numa fase em que o caso pupal pode ser remover sem matar a pupa, geralmente cerca de 10 a 14h após a formação pupário). Conseguimos visualizar proteínas juncionais, proteínas do citoesqueleto e reguladores de tráfico na vesícula pupal células epiteliais (dados não publicados).

A técnica de montagem pupal também nos permitiu desenvolver um método para estruturas imagem cuticular em pupas fase tardia usando o microscópio de varredura confocal, a fim de visualizar a morfologia dos mecanosensorial cerdas e pêlos epidérmicos usando a autofluorescência intrínseca da cutícula. Estas imagens se assemelham a microscopia eletrônica de varredura de cutícula voar, mas pode ser adquirido a partir de animais vivos, e nos permite visualizar simultaneamente a morfologia cuticular e expressão de GFP de fluorescência ^6,7,12.

Materiais

• Scotch tape vara dupla
• Lâmina de vidro
• 18mmX18mm lamela
• Fórceps
• Whatman papel
• Dow Corning graxa de vácuo Silicone
• Seringa de 5 ml
• Pipeta
• Microscópio confocal ou epifluorescência