Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar repetitivos In vivo Imagem da medula espinhal usando microscopia de dois fótons é descrito. Este método combina um dispositivo de estabilização da coluna vertebral e um regime anestésico para minimizar respiratória induzida por movimentos e produzir dados de imagem-primas que não necessitam de alinhamento ou de outras pós-processamento.
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Artigo de método
Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia
Neste artigo
Resumo
Resumo
In vivo de imagens usando microscopia de dois fótons 1 em ratos que foram geneticamente modificados para expressar proteínas fluorescentes em células específicas 2-3 tipos ampliou significativamente o nosso conhecimento dos processos fisiológicos e patológicos em tecidos diversos in vivo 4-7. Em estudos do sistema nervoso central (CNS), tem havido uma ampla aplicação de imagem in vivo em no cérebro, que produziu uma infinidade de novas descobertas e muitas vezes inesperadas sobre o comportamento das células, como neurônios, astrócitos, microglia, sob condições fisiológicas ou patológicas 17/08. No entanto, complicações na sua maioria técnicos limitaram a implementação de imagem in vivo em estudos da medula espinhal de rato vivo. Em particular, a proximidade anatômica da medula espinhal para os pulmões eo coração gera movimento significativo artefato que faz imagens do cordão espinhal vivendo uma tarefa desafiadora. Nós desenvolvemos um novo método que supera as limitações inerentes a imagem da medula espinhal através da estabilização da coluna vertebral, reduzindo respiratória induzida por movimentos e facilitando o uso de microscopia de dois fótons para a imagem do cordão espinhal de rato in vivo. Isto é conseguido através da combinação de um dispositivo de estabilização da coluna vertebral personalizado com um método de anestesia profunda, resultando em uma redução significativa do respiratória induzida por movimentos. Este protocolo vídeo mostra como expor uma pequena área da medula espinhal que viver pode ser mantida sob condições fisiológicas estáveis durante longos períodos de tempo, mantendo a lesão tecidual e sangramento ao mínimo. Representante imagens brutas adquiridas em detalhe vivo em alta resolução a estreita relação entre microglia e da vasculatura. Uma seqüência timelapse mostra o comportamento dinâmico de processos microglia na medula espinhal de rato vivo. Além disso, uma varredura contínua do mesmo z-frame demonstrars a estabilidade excepcional que este método pode conseguir para gerar pilhas de imagens e / ou filmes timelapse que não exigem o alinhamento da imagem pós-aquisição. Por fim, mostramos como esse método pode ser usado para rever e recriar a mesma área da medula espinhal em intervalo de tempo mais tarde, permitindo estudos longitudinais de curso processos fisiológicos ou patológicos in vivo.
Protocolo
1. Construção do dispositivo de estabilização da coluna vertebral
- Ordem do Narishige STS-A Compact Grampos da Medula Espinhal e os Narishige MA-6N adaptador segurando a cabeça.
- Design personalizado e fazer uma placa base de aço inoxidável para segurar as duas partes Narishige em alinhamento de modo que a cabeça do animal é suportado quando a sua coluna vertebral e da cauda são pinçadas. Tenha em mente que todo o dispositivo deve caber sob a lente do microscópio geralmente em um estágio do microscópio baixou.
2. Cirurgia de animais
- Pré-aquecer a câmara de microscópio com um dispositivo de aquecimento d....
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Discussão
O método descrito aqui permite estável e repetitivo in vivo de imagem de densamente povoadas fluorescentes estruturas celulares na medula espinhal de ratos anestesiados com microscopia de dois fótons. A estabilidade alcançada é resultado de um dispositivo de estabilização custom-made espinhal e um regime anestésico que reduz respiratória induzida pelo artefato movimento. O dispositivo de estabilização da coluna vertebral permite espaço para respirar embaixo do corpo do rato e pode ser construído usando comercia.......
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Divulgações
Não temos nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela National Multiple Sclerosis Society conceder RG4595A1 / T para DD e os subsídios NIH / NINDS NS051470, NS052189 NS066361 e as Figuras KA e filmes adaptados e / ou reimpressão do Davalos et al. Métodos J Neurosci. 2008 Mar 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, com permissão da Elsevier.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Rodamina B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluído em ACSF (3% w / v) |
| Ketamina HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Injetável, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | NADA Não: 139-236 | Injetável xilazina, 20mg/ml |
| Acepromazina | Vedco | NADA Não: 117-531 | Injetável, 10mg/ml |
| Lágrimas artificiais pomada | Phoenix farmacêutico | NDC No: 57319-760 - 25 | Lubrificante |
| Betadine | Pescador | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Tesoura | Precision mundo Instrumentos | 555500S | Curva, ponta romba tesoura |
| Pinça reta | Precision mundo Instrumentos | 555047FT | Dentada forceps ponta |
| De pequenos vasos cauterize | Multa Ferramentas Ciência | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia, Pfizer Inc. | Mixer Moinho MM400 | |
| Medula espinhal Compact grampos | Narishige | STS-A | |
| Adaptador de cabeça, segurando | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp | 80-6421-43 | |
| Lactato de Ringer | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC n º: 12496 - 6757-1 | Buprenorfina, injetável |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacina, antibacteriana injetável 2,27% (20ml) |
| Almofada de aquecimento - Grande | Multa Ferramentas Ciência | 21060-10 |
Referências
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G.
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Reimpressões e permissões
