Artigo de método

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

DOI:

10.3791/2763

⸱

26 de março de 2011

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Oncology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Resumo

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Desenvolvimento da doença e progressão são caracterizados por freqüentes aberrações genéticas e epigenéticas, incluindo rearranjos cromossômicos, os ganhos e perdas no número de cópias e metilação do DNA. Avanços em alto rendimento, tecnologias genome-wide perfis, tais como microarrays, têm melhorado significativamente nossa capacidade de identificar e detectar essas alterações específicas. No entanto, como tecnologia continua a melhorar, continua sendo um fator limitante da qualidade da amostra e disponibilidade. Além disso, informações de acompanhamento clínico e prognóstico da doença são muitas vezes coletados anos após a coleta da amostra inicial. Espécimes, normalmente fixado em formalina e incluídos em parafina (FFPE), são armazenados em arquivos hospital por anos a décadas. DNA pode ser eficiente e eficaz recuperado de parafina espécimes se o método adequado para a extração é aplicada. DNA extraído de alta qualidade a partir de amostras devidamente preservados e armazenados pode suportar ensaios quantitativos para comparações de tecidos normais e doentes e geração de assinaturas genéticas e epigenéticas 1. Para extrair o DNA de amostras de parafina, fragmentos de tecido ou tecido microdissecção são submetidos a tratamento xileno, que dissolve a parafina do tecido, e depois reidratados usando uma série de lavagens de etanol. Proteínas e enzimas prejudiciais, tais como nucleases são posteriormente digeridos por proteinase K. A adição de tampão de lise, que contém agentes desnaturantes, como dodecil sulfato de sódio (SDS), facilita a digestão 2. Ácidos nucléicos são purificados a partir do lisado dos tecidos usando tampão saturada centrifugação velocidade fenol e alta, que gera uma solução bifásica. DNA e RNA permanecem na fase aquosa superior, enquanto que as proteínas, lipídios e polissacarídeos são seqüestrados na inter-orgânicos e fases, respectivamente. Retenção da fase aquosa e repetidas extrações fenol gera uma amostra limpa. Após extrações fenol, RNase A é adicionado para eliminar RNA contaminantes. Extrações adicionais fenol seguintes incubação com RNase A são utilizados para remover qualquer enzima restantes. A adição de acetato de sódio e isopropanol DNA precipita, e centrifugação de alta velocidade é usada para sedimentar o DNA e facilitar a remoção isopropanol. Excesso de sais transitadas de precipitação podem interferir com a subseqüente ensaios enzimáticos, mas pode ser removida do DNA por lavagem com etanol 70%, seguido por centrifugação a re-pellet o DNA 3. DNA é re-suspensas em água destilada ou a reserva de escolha, quantificado e armazenado a -20 ° C. DNA purificado pode posteriormente ser utilizado em aplicações a jusante, que incluem, mas não estão limitados a, PCR, matriz hibridização genômica comparativa 4 (array CGH), imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP) e seqüenciamento, permitindo uma análise integrada de amostras de tecido / tumor.

Protocolo

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1. Notas processuais

  • Xileno e fenol são produtos químicos tóxicos e devem ser tratadas em um fumehood. Consulte a folha de dados material de segurança (MSDS) antes de usar.
    • dissolve certos plásticos, tubos de polipropileno devem ser utilizados como eles toleram estes compostos.
  • Dicas especiais podem ser adquiridos que contêm uma rolha de carvão interno. Isso evita que o xileno de dissolver todos os componentes de borracha na pipeta. Alternativamente, filtros podem ser utilizados.

2. Remoção de parafina

  1. Em um fumehood, adicione 800 mL de xileno (VWR, CABDH6216-4) para o tubo rotulado contendo o seu exemplar e coloque sobre um roqueiro, agitando suavemente por 5 a 15 minutos para dissolver a parafina.
  2. Pellet a amostra girando à velocidade máxima (14.000 rpm ou 16 000 xg) em microcentrífuga por 3 minutos. Retire cuidadosamente o sobrenadante xileno e dispor em um tubo de polipropileno para descarte dos resíduos xileno. Tenha cuidado para não perturbar o sedimento.
  3. Repita os passos de lavagem xileno 1 e parafina 2until é completamente dissolvido. Isso geralmente requer 2-3 lavagens, dependendo do tamanho da amostra de tecido. Uma amostra completamente dissolvido aparecerá macio, e, às vezes, perder a sua integridade estrutural. A integridade da amostra pode ser avaliada com cuidado com uma ponta da pipeta.

3. Reidratação etanol

  1. Adicionar 800 mL de etanol a 100% (v / v) grau de biologia molecular do etanol vortex, em seguida, girar por 3 minutos a 14.000 rpm em microcentrífuga. Retire o sobrenadante etanol, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
  2. Adicionar 800 mL de etanol 70% (100% (v / v) de etanol diluído em água destilada (dH 2 O)) vortex, e girar por 3 minutos a 14.000 rpm. Remova cuidadosamente o sobrenadante etanol.
  3. Adicionar 800 mL de etanol 50% (100% (v / v) de etanol diluído em água destilada (dH 2 O)) vortex, e girar por 5 minutos a 14.000 rpm. Remova cuidadosamente o etanol tanto quanto possível, por pipetagem. Ser extremamente cuidadosa de perturbar o sedimento neste momento como o tecido completamente reidratadas não pellet, assim como tecido desidratado.
  4. Depois de remover o sobrenadante etanol, secar o pellet por 5 minutos, sendo o cuidado de não mais seca.

4. Digestão dos tecidos

  1. Adicionar 200-500 mL de tampão de lise (fórmula abaixo). Re-suspender o pellet utilizando uma ponteira ou um vórtice. Esforço extra neste momento para re-suspender completamente o tecido irá resultar em uma digestão mais completa da amostra e um melhor rendimento de DNA.
  2. Incubar as amostras a 56 ° C em banho-maria ou bloco de aquecimento.
  3. Para fragmentos de tecido, ponto 20 l de proteinase K (20 mg / ml solução estoque, Invitrogen, AM2548) de manhã e à noite.
  4. Repita os passos acima digestão de 2 a 5 dias até que o tecido é completamente dissolvido.

Tampão de Lise

  • 10 mM Tris-HCl pH 8,0
  • 100 mM EDTA pH 8,0
  • 50 mM NaCl
  • SDS 0,5%
  • 200 mg / ml proteinase K (adicione imediatamente antes da utilização)

    • 5. DNA limpar

    1. Adicionar um volume igual de tampão saturada de fenol (Fisher, BP1750I-400) e misturar por inversão. Rotação por pelo menos 5 minutos a 14.000 rpm em microcentrífuga.
    2. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Observe a interfase: existe uma grande quantidade de material branco?
    3. Repita os passos 1 e 2 na fração aquosa até que a interfase é claro (geralmente três ou mais vezes). Realizar extrações de volta * quando a interfase é distorcido para aumentar o rendimento final.
    4. Uma vez que a interfase é claro, adicionar igual volume de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) para a fração aquosa extraída de sua amostra. Misturar por 5 minutos e depois girar por 5 minutos a 14.000 rpm. Thisreduces residual de fenol e ainda aguça a interfase, facilitando a extração da camada aquosa
    5. Retire a camada aquosa para um novo tubo e treatwith RNase A a 100 mg / ml durante 1 hora a 37 ° C.
    6. Repita os passos 1-4 para remover qualquer RNase remanescentes A e recolher a fração aquosa. Você só deve precisar de 1 ou 2 tampão saturada passos fenol como deve haver muito menos proteína para remover do que no lisado inicial.

    * Para realizar extrações de volta adicionar 50-100 mL de dH 2 0 para o tubo de amostra contendo a interfase ea parte orgânica. Inverter o tubo para misturar, e girar a amostra a 14.000 rpm em microcentrífuga por cinco minutos. Coletar a fase aquosa e adicioná-lo à extração aquosa adquiridos anteriormente. Continue até a volta extrações interfase é clara.

    6. DNA precipitação

    1. Estime o volume de sua camada aquosa recolhida.
    2. Adicione 1 / 10 do volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 1 volume de 100% de grau de biologia isopropanol (v / v) molecular (ou 2,5 volumes de etanol 100%).
    3. Misture bem e coloque em gelo ou em um freezer -20 ° C por 30 minutos ou durante a noite.
    4. Spin na velocidade máxima (14.000 rpm) a 4 ° C em microcentrífuga por 10 minutos
    5. Descartar o sobrenadante.
    6. Lave o pellet com etanol 70% de gelo fria para remover sais indesejados.
    7. Re-suspender o pellet no buffer de escolha (geralmente dH 2 O).

    7. Quantificação de DNA

    1. Quantificar a concentração de DNA. O A260: A280 relação deve ser ~ 1.8. Para pequenas quantidades de DNA, medição utilizando um espectrofotômetro NanoDrop é o preferido.
    2. Após a quantificação, eletroforese em gel devem ser realizados para testar a qualidade do seu DNA de amostras e determinar se a contaminação RNA foi completamente degradada.
    3. Alta qualidade de DNA extraído é agora adequado para aplicações a jusante, ou podem ser armazenadas a -20 ° C para uso posterior. Se RNA ainda está presente na sua amostra, repetir o DNA e as etapas de limpeza, precipitação e re quantificar e qualificar a qualidade de suas amostras.

    Discussão

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    Tecidos biopsiados ou extirpado cirurgicamente para análise histopatológica eo diagnóstico muitas vezes são fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) para o armazenamento de longo prazo. Com o crescente interesse na compreensão da base genética da doença, a capacidade de extrair DNA dessas amostras representam uma valiosa fonte de material de diagnóstico que pode ser usado para a análise genômica e estudos translacionais. Amostras historicamente FFPE não foram consideradas uma fonte viável para a análise molecular de ácidos nucléicos podem ser pesadamente modificadas por ácido nucléico e proteína-proteína-proteína reticulação 6. No entanto, a descoberta de que a digestão protease releases fragmentada ácidos nucléicos que são adequados para análises a jusante, incluindo PCR, CGH array, seqüenciamento e perfil de metilação, permite o uso destes espécimes valiosos para a análise genética 6.

    Extração de DNA de tecidos incluídos em parafina é um procedimento robusto que depende de solubilidade diferencial para purificar DNA. Qualidade do DNA extraído ea quantidade eo sucesso da amplificação do DNA subseqüente é dependente de um número de parâmetros antes, durante e após a extração. Estes incluem, mas não estão limitados a: tipo e quantidade de tecido, o tipo de fixador utilizado para preservação de tecido, a duração da fixação, a idade do bloco de parafina e as condições de armazenagem, bem como o comprimento do segmento de DNA que se deseja amplificado 1,7. Remoção de parafina do tecido é a etapa mais crítica para a extração de sucesso como a parafina não dissolvido leva a qualidade da amostra pobres e inibição da PCR.

    Divulgações

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    Não há conflitos de interesse declarados.

    Agradecimentos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Lam para a sua avaliação e críticas deste vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research.

    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Nome Companhia Número Catálogo Comentários
    Xileno VWR CABDH6216-4 -
    1,7 ml SafeSeal tubos de microcentrífuga Sorenson BioScience 11510 -
    Spectrafuge Microcentrífuga 16M Labnet C0160-B -
    Tampão de Lise - - 10 mM Tris-HCl PH8,
    100 mM EDTA pH 8,
    50 mM NaCl,
    0,5% SDS,
    200 mcg / ml proteinase K
    Proteinase K Solução stock Invitrogen AM2548 20 mg / ml
    Proteinase K Solução stock
    Tampão saturada de fenol pH 6.6/7.9 Pescador BP1750I-400 -
    Fenol: clorofórmio: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) Pescador BP1752I-400 -
    A RNase Roche 10109169001 100mg
    3M pH acetato de sódio 5,2 - - 40.81g NaOAc em 80ml
    Acertar a pH 5,2 com ácido acético glacial
    Adicionar dH 2 O para 100ml
    Autoclave
    ND Espectrofotômetro 3300 NanoDrop - -

    Referências

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
    2. Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
    3. Sambrook, J. oseph, R, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
    4. Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
    5. Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
    6. Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
    7. Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).

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