Este artigo descreve uma In vitro Técnica para células cancerosas invasoras de monitorização por meio de uma monocamada de células endoteliais. Os dados são adquiridos em tempo real, como uma função de alterações na impedância sobre a superfície de eléctrodos no fundo bem.
Artigo de método
A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Disseminação metastática de células malignas requer degradação da membrana basal, a ligação de células de tumor ao endotélio vascular, a retracção das junções endoteliais e, finalmente, a invasão e a migração de células tumorais através da camada endotelial para entrar na corrente sanguínea, como meio de transporte para locais distantes do hospedeiro 1-3. Uma vez que no sistema circulatório, as células cancerígenas aderem à parede capilar e extravasar para o tecido circundante de modo a formar tumores metastáticos 4,5. Os vários componentes de interacção célula-célula endotelial tumoral pode ser replicado in vitro por desafio de uma monocamada de células endoteliais humanas da veia umbilical (HUVEC) com as células cancerosas. Estudos realizados com elétrons e microscopia de contraste de fase sugerem que a seqüência em vitro de eventos representam adequadamente o processo metastático in vivo 6. Aqui, descrevemos uma técnica baseada em impedância elétrica que monitora e quantifica em tempo real, as invasião de células endoteliais de células tumorais malignas.
Giaever Keese e descrita pela primeira vez uma técnica para medir as flutuações na impedância quando uma população de células crescem sobre a superfície dos eléctrodos 7,8. O instrumento xCELLigence, fabricado pela Roche, utiliza uma técnica semelhante para medir as variações na impedância eléctrica como células de prender e espalhado num prato de cultura coberta com uma matriz de microeléctrodos de ouro que cobre cerca de 80% da superfície da parte inferior do poço. Como as células anexar e espalhada sobre a superfície do eléctrodo, ele conduz a um aumento na impedância eléctrica 9-12. A impedância é apresentada como um parâmetro sem dimensões denominado índice de células, que é directamente proporcional à área total do poço de cultura de tecidos, que é coberto por células. Assim, o índice de célula pode ser usado para monitorar a adesão celular, espalhamento, a morfologia e a densidade de células.
O ensaio de invasão descrito neste artigo é baseado em mudançasna impedância eléctrica no eléctrodo / células de interfase, como uma população de células malignas invadem através de uma monocamada de HUVEC (Figura 1). A ruptura das junções endoteliais, retracção da monocamada de células endoteliais e sua substituição por células tumorais levar a grandes alterações na impedância. Estas alterações directamente correlacionadas com a capacidade invasiva de células tumorais, isto é, a invasão por células altamente agressivos levar a grandes alterações na impedância de células e vice-versa. Esta técnica proporciona uma dupla vantagem em relação aos métodos existentes de medição, tais como invasão câmara de Boyden e ensaios matrigel: 1) a interacção célula-célula endotelial tumoral imita mais de perto o processo in vivo, e 2) os dados são obtidos em tempo real, tempo e é mais facilmente quantificáveis, em oposição a análise de ponto final para outros métodos.
Protocolo
1. Preparação
- Todos os passos devem ser realizados em condições estéreis, numa câmara de cultura de tecidos.
- A estação xCELLigence é colocada numa incubadora de 37 ° C na presença de 5% de CO 2.
- Use células HUVEC passagem baixas, de preferência, não mais do que a passagem 6. Além disso, certifique-se de que as células não são mais do que 75% confluente no momento da colheita.
- As células HUVEC são cultivadas em meios EGM-2 reconstituídos com kit EGM-2 bala (Lonza Biosciences) contendo factores de crescimento, suplementos e 5% de soro fetal bovino.
- Todos os vestígios de tripsina devem ser removidos a partir de suspensões de células por centrifugação a 200xg células, lavagem uma vez com PBS, e ressuspensão de densidades celulares indicadas.
- Revestimento xCELLigence E-chapa 16 com 0,1% de gelatina durante 1 hora a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C. Lavar a placa com PBS e adicionar 100 uL reconstituído mídia EGM-2. Realizar uma leitura em branco no sistema xCELLigence para medir fundoimpedância na ausência de células.
2. Gerando monocamada HUVEC
- Colher um frasco de sub-confluente de células HUVEC por tripsinização. Ressuspender as células em reconstituídos EGM-2 Meios para uma densidade final de 2,5 x 10 5 células / ml.
- A cada poço de uma base calibrado E-placa contendo 100 ul de meio EGM-2, adicionar 100 uL da suspensão de células HUVEC (2,5 x 4 10 células HUVEC).
- Instalar imediatamente E-Plate no instrumento xCELLigence.
- Software xCELLigence programa para realizar leituras de impedância em intervalos de 10 minutos.
- Permitir que as células endoteliais para crescer 18-21 horas até se formar uma monocamada, como evidenciado por um achatamento do índice de células (Figura 2).
3. Além das células e normalização de dados invasor.
- Uma vez que uma monocamada de HUVEC estável formado, a colheita de células tumorais por tripsinização e ressuspender a um tocas finaisdade de 1 x 10 5 células / ml em meios utilizados para crescer células tumorais (tais como meios RPMI ou DMEM contendo 10% de FBS)
- Leituras de impedância pausa do software xCELLigence e remover E-Plate da estação.
- Remover EGM-2 media por aspiração. Adicionar 100 uL de suspensão de células de tumor contendo 1 x 4 10 células. Geralmente, uma proporção de células de tumor de 1:2,5: células endoteliais semeadas, funciona melhor para o ensaio. No entanto, a proporção pode ser optimizado para as linhas de células individuais.
- Colocar a placa de E no sistema xCELLigence na incubadora e continuar leituras de impedância em intervalos de 10 minutos.
- Invasão pode ser monitorado em tempo real ao longo dos próximos 6-12 horas como uma queda no índice de células devido à retração das junções endoteliais e penetração de invadir as células tumorais.
- Normalizar os resultados para o momento da adição de invadir as células tumorais. O software xCELLigence permite a normalização de qualquer ponto de tempo e os resultadospode ser visto directamente na janela do software.
4. Resultados representativos:
Um exemplo de monocamada HUVEC invasão por células metastáticas e não metastáticas é mostrado na Figura 3. K7M2 é uma linha de células de osteossarcoma metastático. Estas células expressam níveis elevados da proteína do citoesqueleto ezrina ligante, que representa as propriedades invasivas de esta linha celular 13,14. Quando as células HUVEC são desafiados com K7M2 células, há uma queda na resistência eléctrica dentro de 6 horas. Esta queda na resistência eléctrica representa a invasão de monocamada HUVEC pelas células do tumor invasoras. A linha de células K12, por outro lado, expressa níveis muito mais baixos de ezrina e é, consequentemente, menos metastático 13. Um desafio a monocamada de HUVEC com K12 células resulta em uma diminuição menos acentuada da resistência à medida que as células são incapazes de aderir ou invadir através da monocamada de HUVEC (Figura 3).
Figura 1. Diagrama esquemático do processo de fluxo de trabalho para a invasão de células endoteliais por células tumorais. As células HUVEC foram semeadas em placas de E-revestidos de gelatina para permitir a formação de uma monocamada confluente. As células malignas são adicionados uma vez por monocamada formou e invasão é monitorado em tempo real como o índice da célula muda devido à invasão da monocamada endotelial.
Figura 2. Formação de monocamada HUVEC. Mudanças no índice de células como células HUVEC juntar-se e espalhar sobre eletrodos de ouro gelatina revestidos. A formação de uma monocamada confluente é representado por uma estabilização do índice de células após 18 horas.
Figura 3. Invasão de células HUVEC por K7M2 e K12 células de osteossarcoma. A queda acentuada no cell-índice ocorre dentro de poucas horas após a introdução das células altamente metastáticas K7M2. K12 células, por outro lado, são menos metastático e são incapazes de penetrar na monocamada endotelial tão eficientemente quanto K7M2 células. Isto é representado por uma diminuição no índice de menos acentuada quando a monocamada de células HUVEC é desafiado com células K12. Controlo representa uma impedância de monocamada HUVEC, na ausência de células de cancro. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Discussão
O ensaio de invasão HUVEC em tempo real é um método simples, mas poderosa para a invasão de monitoramento. Ele fornece resultados em tempo real, o que é uma vantagem significativa em relação a outras técnicas tradicionais, que se baseiam na análise de ponto final. O ensaio pode ser modificado para testar drogas, anticorpos, ligandos e proteínas como inibidores ou estimuladores da metástase. O efeito de diferentes agentes na endotelial / célula cancerosa conversa cruzada pode ser avaliada, bem. Quando a introdução de agentes exógenos, tais como factores de crescimento e os medicamentos nos meios de cultura, é importante para garantir que eles não afectam a integridade da monocamada de HUVEC. Perturbação da monocamada HUVEC pode ser testada através da introdução do agente exógeno na ausência de células invasoras, e garantir que não existe qualquer alteração no índice de células. Assim, os controles apropriados devem ser incluídos como parte do projeto experimental.
Linhas celulares diferentes demonstrar diferentes curvas de índice de células, que formam um confmonocamada luent. A forma da curva, bem como o valor máximo do índice da célula atingida, é do tipo de célula específico. Células HUVEC mostram uma característica transitória achatamento do índice de célula de 4-6 horas após a semeadura, seguido por outro de estabilização em um índice maior de células após 16-18 horas. Por isso, é importante para permitir que as células formam uma monocamada confluente durante pelo menos 18 horas antes da adição de células tumorais.
Uma vez que o índice de células está dependente do ambiente iónico no eléctrodo / células de interfase, por vários factores tais como a morfologia celular e qualidade de adesões célula-célula influenciar o índice de células, para além da área do poço inferior coberta. Assim, a diminuição no índice de célula, que ocorre após a invasão de células de tumor, é uma função de diversos factores, que incluem a retracção das junções endoteliais e invasão de células de tumor subsequente.
O instrumento xCELLigence é fabricado em três diferentes configurações: analisador de células em tempo real(RTCA) SP, RTCA MP e RTCA DP. O instrumento RTCA SP detém uma de 96 poços E-plate Considerando que o instrumento RTCA MP pode conter até seis de 96 poços E-chapas simultaneamente. Isto permite o rastreio de alto rendimento de drogas e compostos. Os experimentos deste artigo são realizadas utilizando o instrumento DP RTCA, que pode realizar três de 16 poços E-placas. Cada estação de realização E-plate pode ser operado de forma independente, o que permite que múltiplos usuários para executar experiências em simultâneo. O instrumento RTCA DP pode também ser usado para estudar a migração usando CIM-chapas. Estes são pratos de 16 poços com câmaras superior e inferior separadas por um tereftalato de polietileno (PET) de membrana com um tamanho de poro médio do 8um. Os sensores electrónicos estão localizados no lado de baixo da membrana porosa da câmara superior. A câmara inferior serve como um reservatório para o quimioatraente para células na câmara superior. No entanto, uma das principais vantagens do ensaio de invasão HUVEC nas placas CIM é que a invasão de células tumorais na ex-inão é restringida pelo tamanho do poro, como a invasão de células endoteliais depende de conversa cruzada entre as células tumorais e endoteliais.
O ensaio de invasão de HUVEC também pode ser realizada em ECIS Z instrumento, fabricado por Biofísica Aplicada (Troy, NY). O Z instrumento ECIS utiliza uma tecnologia semelhante ao instrumento xCELLigence, com diferenças nas configurações da matriz e eletrodo. Temos realizado com sucesso testes de invasão HUVEC usando as matrizes ECIS oito poços. É importante notar que a área de superfície bem inferior é maior nas matrizes ECIS, o que requer um maior número de células endoteliais e de tumor seja banhado: 2,5 x 10 5 a 1 x 10 5 células, respectivamente.
Divulgações
O custo para a publicação desse manuscrito foi gentilmente cedido pela Roche Applied Science.
Agradecimentos
Este trabalho foi generosamente apoiado por fundos da Fundação do Câncer Infantil (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) e NIH (R01CA108641).
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Anton Wellstein e membros de seu laboratório para compartilhar sua experiência e nos ajudando a otimizar métodos apresentados.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Estação xCELLigence RTCA DP |  Roche Group | 05469759001 | |
| Unidade de controle RTCA | Roche Group | 05454417001 | Notebook com software RTCA pré-instalado |
| Placa E-16 | Roche Group | 05469830001 | |
| Células HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| Meio EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Kit Bullet EGM-2 | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| Gelatina 0,1% em H2O estéril | EMD Millipore | MCPROTO045 |
Referências
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Reimpressões e permissões
