Um procedimento simples de vibratome seccionando o órgão de Corti, seguido por microscopia confocal e imuno-histoquímica é descrito. Este procedimento permite uma melhor preservação da citoarquitetura fino do órgão de Corti de mamíferos e, conseqüentemente, permite a quantificação precisa dos tipos de células.
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Artigo de método
Vibratome Seccionamento de Preservação melhorada da citoarquitetura do Órgão de Corti de mamíferos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O órgão de mamíferos de Corti é um mosaico altamente ordenada celular de cabelo e não-sensorial mecanosensorial células de suporte
(Revisto em 1,2). Visualização deste mosaico celulares freqüentemente requer que o órgão de Corti é transversa. Em particular, o pilar não-sensorial e células Deiters ', cujos núcleos estão localizados basally com relação às células ciliadas, não pode ser visualizada sem cross-seccionando o órgão de Corti. No entanto, a citoarquitetura delicada do órgão de Corti de mamíferos, incluindo os processos de multa citoplasmática do pilar e células Deiters ', é difícil de preservar pela rotina de procedimentos histológicos, tais como parafina e crio-seccionamento, que são compatíveis com as técnicas de coloração imuno-histoquímica.
Aqui eu descrevo um procedimento simples e robusta consistindo de vibratome seccionamento da cóclea, coloração imuno-histoquímica destas seções vibratome no monte todo, seguido por microscopia confocal. Este procedimento tem sido utilizado amplamente para a análise immunhistochemical de múltiplos órgãos, incluindo o broto de membro mouse, gut zebrafish, fígado, pâncreas e coração (ver 3-6 para exemplos seleccionados). Além disso, este procedimento foi bem sucedida para ambos imagem e quantitificaton do número de células em órgãos pilar mutante e controle de Corti em ambos os embriões e camundongos adultos 7. Este método, no entanto, atualmente não é amplamente usado para examinar o órgão de mamíferos de Corti. O potencial para este procedimento para tanto proporcionar a preservação do maior bem citoarquitetura do órgão de Corti e adultos permitem a quantificação de vários tipos celulares é descrito.
Protocolo
1. Isolamento e fixação do ouvido interno
- Para análise dos padrões celulares no órgão de Corti, euthanize adequadamente encenado embriões ou adultos.
- Dissecar a cápsula ótica, contendo a orelha interna membranosa. No mouse, isso pode ser feito facilmente em embriões de embriões (E) 14,5 dias e mais velhos, em que E0.5 é o dia em que um plug vaginal foi detectada. Dissecção da cápsula ótica é realizada primeiro por decapitação e abertura do crânio, na linha média. Retire do cérebro para expor cada orelha (Fig. 1A). Ouvido interno podem ser descascados fora intacta usando uma pinça (como Dumont n º 5, fig. 1B). Se a imagem do órgão de Corti, remoçã....
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Discussão
O procedimento de corte vibratome, seguido por imagem imunohistoquímica e confocal permite a visualização do órgão de Corti com dano tecidual mínimo. Claramente, as imagens tiradas de confocal regiões do interior da seção vibratome mostram excelente preservação da morfologia celular, que é limitada apenas por artefatos de fixação. Confocal imagens tomadas perto das duas superfícies de corte de uma seção vibratome são muitas vezes indistinguíveis a partir de imagens de regiões internas, embora ocasionais interrupções cel.......
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Divulgações
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Colégio Médico de Wisconsin IACUC.
Agradecimentos
O autor gostaria de reconhecer o uso de Investigação de Crianças Núcleo de Imagem Instituto de microscopia confocal e Jian Zhang para a sugestão de montar seções usando pérolas de agarose. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DC010387.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Leica VT1000S vibratório Lâmina micrótomo | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser de microscópio de varredura confocal | Zeiss | ||
| Estudante Dumont # 5 Pinça | Multa Ferramentas Ciência | 91150-20 | |
| UltraPure baixo ponto de fusão Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way molde incorporação | Polysciences | 18.986 ou 18646A | |
| albumina de soro bovino | ImmunoResearch Jackson | 001-000-162 | |
| O soro de cabra | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 cabra anti-IgG de coelho | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 diluição |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| graxa de vácuo | Pescador | S41718 | |
| Affi-Gel Gel Azul | Bio-Rad | 153-7301 |
Referências
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y.
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Reimpressões e permissões
